Personalized medicine in cancer: liquid biopsy-based biomarkers

Abstract

Liquid biopsy is a non-invasive approach that provides tumour molecular profiling and may assist in the management of cancer patients. Therefore, here we investigated the utility of liquid biopsy-based biomarkers as prognostic tools in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and metastatic colorectal cancer (CRC) patients. Specifically, circulating cell-free DNA (cfDNA) level and fragmentation were determined in plasma, and BEAMing technique was used for quantitative determination of RAS mutation allele fraction (MAF) in cfDNA. Additionally, a TaqMan real-time PCR assay was used to quantify basal circulating levels of 754 microRNAs (miRNAs) in plasma of metastatic CRC patients treated with anti-angiogenic therapy. For pancreatic cancer studies, plasma was obtained from 61 metastatic PDAC patients. We found that prognosis was more accurately predicted by RAS mutation detection in plasma than in tissue, and RAS mutation status in plasma was a strong independent prognostic factor for both overall survival (OS) and progression-free survival (PFS). Moreover, RAS MAF in cfDNA was also an independent risk factor for poor OS and was strongly associated with primary tumours in the body/tail of the pancreas and liver metastases. Higher cfDNA levels and fragmentation were also associated with poorer OS and shorter PFS, body/tail tumours, and hepatic metastases, whereas cfDNA fragmentation positively correlated with RAS MAF. Remarkably, the combination of CA19-9 with cfDNAbased biomarkers improved the prognostic stratification of PDAC patients. Furthermore, dynamics of RAS MAF better correlated with patients’ outcome than standard CA19-9 marker. Of note, PDAC is characterized by a highly inflammatory microenvironment, and we found that neutrophil-lymphocyte ratio (NLR) was significantly associated with both OS and PFS. Remarkably, NLR was an independent risk factor for poor OS. Moreover, NLR and platelet-lymphocyte ratio (PLR) positively correlated, and combination of both inflammatory markers significantly improved the prognostic stratification of metastatic PDAC patients. Notably, NLR showed a positive correlation with cfDNA levels and RAS MAF and we found that neutrophil activation contributed to cfDNA content in the plasma of metastatic PDAC patients. Finally, a multiparameter prognosis model was designed by combining inflammatory markers, cfDNA-based markers and CA19-9, which performs as a promising tool to predict the prognosis of metastatic PDAC patients. For the study of cfDNA-based biomarkers in CRC, plasma was obtained from 136 metastatic CRC patients. Likewise, RAS mutation detection in plasma rather than in tissue, more accurately predicted the prognosis of these patients. Moreover, RAS MAF in cfDNA was also associated with poor OS and was strongly related with liver metastases and number of metastatic locations. Higher cfDNA levels and fragmentation positively correlated and they were also associated with worse prognosis and hepatic metastases. Remarkably, the combination of standard CEA marker with plasma RAS status and cfDNA levels improved the prognostic stratification of patients. For the miRNA profiling study, plasma was obtained from 98 metastatic CRC patients enrolled in a clinical phase II trial before receiving FOLFIRI plus aflibercept treatment. A distinct profile of circulating miRNAs was found between responder and non-responder patients. Remarkably, most of these miRNAs were found to have predicted target genes that are involved in angiogenic processes. Accordingly, some of these miRNAs entered in predictive models of response to therapy, progression of disease and survival of patients treated with FOLFIRI plus aflibercept. Among these miRNAs, circulating levels of hsa-miR-33b-5p efficiently discriminated between responders and non-responders patients and predicted the risk of disease progression. In conclusion, our study supports the use of cfDNA-based liquid biopsy biomarkers as clinical tools for the non-invasive prognosis and monitoring of metastatic PDAC patients. Besides, the use of systemic inflammatory markers along with circulating tumour-specific markers greatly improves prognostic power and provides accurate survival risk stratification of these patients. Likewise, the use of both cfDNA-based and miRNA-based liquid biopsy markers may greatly help in the non-invasive prognosis of metastatic CRC patients and in the prediction of their response to anti-angiogenic therapy.

La biopsia líquida es una técnica no invasiva que proporciona un perfil molecular del tumor y que puede ser de gran ayuda en el manejo de los pacientes con cáncer. Por lo tanto, en este estudio se investigó la utilidad de los biomarcadores basados en biopsia líquida como herramientas pronósticas en pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) metastásico y cáncer colorrectal (CRC) metastásico. Concretamente, se estudiaron los niveles y la fragmentación del ADN libre circulante (cfDNA) en plasma, y se usó la técnica BEAMing para cuantificar la fracción alélica mutada (MAF) de RAS en el cfDNA. Además, se usó un ensayo de PCR a tiempo real con sondas TaqMan para cuantificar los niveles circulantes basales de 754 microRNAs (miRNAs) en el plasma de pacientes con CRC metastásico tratados con terapia antiangiogénica. Para los estudios de cáncer de páncreas, se obtuvo el plasma de 61 pacientes con PDAC metastásico. Encontramos que el pronóstico era más preciso mediante la detección de la mutación de RAS en plasma que en tejido, y que el estado mutacional de RAS en plasma era un fuerte factor pronóstico independiente tanto para la supervivencia global (OS) como para la supervivencia libre de progresión (PFS). Además, la MAF de RAS en el cfDNA también fue un factor de riesgo independiente para una peor OS y estuvo estrechamente asociada con la localización del tumor primario en el cuerpo/cola del páncreas y con las metástasis hepáticas. Los mayores niveles y fragmentación del cfDNA también se asociaron con una peor OS y una PFS más corta, con tumores en el cuerpo/cola del páncreas y con las metástasis hepáticas. Además, los niveles de fragmentación del cfDNA se correlacionaron con la MAF de RAS. De forma notable, la combinación de CA19- 9 con los biomarcadores basados en cfDNA mejoró la estratificación pronóstica de los pacientes con PDAC metastásico. Asimismo, la dinámica de la MAF de RAS correlacionó mejor con la supervivencia de los pacientes que el marcador estándar CA19-9. Hay que destacar que el PDAC está caracterizado por un microambiente altamente inflamatorio, y en nuestro estudio encontramos que la ratio neutrófilolinfocito (NLR) estuvo significativamente asociada tanto con la OS como con la PFS. De hecho, NLR fue un factor de riesgo independiente para una OS pobre. Además, NLR y la ratio plaqueta-linfocito (PLR) estaban correlacionados positivamente, y la combinación de ambos marcadores inflamatorios mejoró significativamente la estratificación pronóstica de los pacientes con PDAC metastásico. De forma notable, NLR mostró una correlación positiva con los niveles de cfDNA y la MAF de RAS y también encontramos que la activación de los neutrófilos contribuyó al contenido de cfDNA en el plasma de los pacientes con PDAC metastásico. Finalmente, se diseñó un modelo multiparamétrico para predecir el pronóstico combinando los marcadores inflamatorios, los marcadores basados en cfDNA y CA19-9, que constituye una prometedora herramienta para predecir el pronóstico de pacientes con PDAC metastásico. Para el estudio de biomarcadores basados en cfDNA en CRC, se obtuvo el plasma de 136 pacientes con CRC metastásico. De manera similar, la detección de mutación en RAS en plasma en lugar de en tejido predijo de forma más precisa el pronóstico de estos pacientes. Además, la MAF de RAS en el cfDNA se asoció también con una OS pobre y estuvo estrechamente relacionada con metástasis hepáticas y el número de localizaciones metastásicas. Los mayores niveles y fragmentación del cfDNA correlacionaron positivamente y también se asociaron con un peor pronóstico y con metástasis hepáticas. Es de destacar que la combinación del marcador estándar CEA con el estado mutacional de RAS en plasma y los niveles de cfDNA mejoró la estratificación pronóstica de los pacientes con CRC metastásico. Para el estudio del perfil de miRNAs, se obtuvo el plasma de 98 pacientes con CRC metastásico incluidos en un ensayo clínico fase II antes de recibir tratamiento con FOLFIRI más aflibercept. Se encontró un perfil diferente de miRNAs circulantes entre pacientes respondedores y no respondedores. Es interesante destacar que la mayoría de estos miRNAs tenían genes diana implicados en procesos angiogénicos. En consecuencia, algunos de estos miRNAs fueron candidatos en modelos de respuesta a terapia, progresión de la enfermedad y supervivencia de pacientes tratados con FOLFIRI más aflibercept. Entre estos miRNAs, los niveles circulantes de hsa-miR-33b-5p discriminaron de forma eficiente entre los pacientes respondedores y no respondedores y predijeron el riesgo de progresión de la enfermedad. En conclusión, los resultados de nuestro estudio apoyan el uso de biomarcadores de biopsia líquida basados en cfDNA como herramientas clínicas para el pronóstico no invasivo y la monitorización de los pacientes con PDAC metastásico. Además, el uso conjunto de marcadores inflamatorios con marcadores circulantes específicos del tumor mejora de forma notable el poder pronóstico y proporciona una estratificación precisa de estos pacientes en función de la supervivencia. Asimismo, el uso tanto de marcadores basados en cfDNA como basados en miRNAs podría ser de gran ayuda en el pronóstico no invasivo de los pacientes con CRC metastásico y en la predicción de su respuesta a terapia antiangiogénica.