Implication of the alternative splicing process in the development of hepatocelular carcinoma

Abstract

Liver cancer represents a complex and heterogeneous pathology that encompasses several types of malignant tumors with unfavorable characteristics and prognosis, including hepatocellular carcinoma or hepatocarcinoma (HCC). HCC is one of the cancers with the worst prognosis and the highest incidence and mortality in the world. Despite the intense characterization and important improvements accomplished in this tumor pathology due to the results obtained by research over years, the diagnostic and therapeutic strategies in HCC are not entirely effective. Therefore, there is a need to find common molecular elements or profiles that facilitate comprehensive and effective diagnostic and therapeutic strategies, and that could improve the prognosis in this devastating pathology. In this sense, some years ago ten common characteristics shared by most types of cancer were proposed. Each of these distinctive cancer features appears to be associated with specific alterations in the splicing process, which in turn leads to a more aggressive and invasive cancer phenotype. Therefore, the splicing process has emerged as a promising alternative for the identification of new biomarkers for the diagnosis and prognosis of various metabolic pathologies and numerous types of cancer, as well as a possible source for the identification of putative therapeutic targets for the treatment of cancer. The splicing process is catalyzed and regulated by an intricate intracellular molecular machinery composed of different macromolecular ribonucleoprotein (RNP) complexes, called spliceosome, and regulated by more than 300 splicing factors. Recent studies have revealed that there is a relationship between the dysregulation of this cellular machinery and different tumor pathologies. However, the role of spliceosome components and splicing factors in the development and/or progression of HCC is not yet fully understood. For all these reasons, the main objective of this thesis was to determine the degree of dysregulation and the possible role of the machinery that controls the splicing process in HCC, as well as the underlying regulatory mechanisms, in order to identify new biomarkers and pharmacological targets with potential to improve diagnostic and therapeutic approaches in this pathology. With this aim, the first step was to explore the gene expression patter of an ample and representative set of spliceosomal components and splicing factors which revealed a profound dysregulation of the splicing machinery in HCC. A more profound analysis through VIP scoring (PLS-DA) showed relevant changes in the expression between tumor and non-tumor adjacent samples of key elements involved in the function of the spliceosome, such as SF3B1 or PRPF8, as well as other important factors, such as KHDRBS3, ESRP2, EIF4A3, or SRPK1. These results led us to further explore the dysregulation and putative role of SF3B1 and PRPF8 in HCC due to the existence of drugs targeting these factors, their importance in the function of the spliceosome, and/or their role in other pathologies. Therefore, the first experimental section of this Thesis aimed to study the role of SF3B1 (splicing factor 3 subunit 1) in HCC, in order to explore its potential as a biomarker and/or therapeutic target in this pathology. First, the expression analysis revealed that SF3B1 is overexpressed (at the RNA and protein level) in HCC in two retrospective cohorts and five in silico cohorts and that its expression was associated with tumor aggressiveness, the expression of oncogenic splicing variants (KLF6-SV1, BCL -XL) and decreased overall survival of the patients. In fact, in vitro, the silencing of SF3B1 reduced cell viability, proliferation, and migration, and its pharmacological blockade with pladienolide-B inhibited proliferation, migration, and tumorosphere, and colony formation in the three liver cancer cell lines used (HepG2, Hep3B, SNU-387), while the effects on proliferation of the normal-like hepatocytederived line THLE-2 were negligible. Pladienolide-B also reduced in vivo growth and tumor markers expression in xenograft tumors induced by Hep3B cells in nude mice. Furthermore, the silencing and/or blocking of SF3B1 modulated the activation of key signaling pathways (PDK1, GSK3b, ERK, JNK, AMPK) and the expression of cancer-associated genes (CDK4, CD24), as well as oncogenic splicing variants (such as KLF6-SV1). In the second experimental section of this Thesis, our objective was to study the deregulation of PRPF8 expression and its possible functional role in HCC. First, PRPF8 expression (at the mRNA / protein level) was analyzed in a retrospective cohort of HCC patients [and validated in two in silico cohorts (TCGA and CPTAC)]. The results indicated that PRPF8 is overexpressed in HCC and is associated with greater tumor aggressiveness (patient survival, etc.), with the expression of HCC splicing variants and with the modulation of critical genes involved in cancer-related pathways. PRPF8 silencing reduced in vitro aggressiveness and decreased tumor growth in vivo. CLIPseq data in HepG2 demonstrated that PRPF8 preferentially binds to exons of protein-encoding genes, and RNAseq analysis showed that PRPF8 silencing alters the splicing of multiple genes. Integrated analysis revealed that the silencing of PRPF8 modulates the splicing of fibronectin (FN1), which promotes the exclusion of exon 40.2, an essential region for the binding of FN1 to integrins. Consequently, PRPF8 silencing reduced FAK / AKT phosphorylation and stress fiber formation. HepG2 and Hep3B cells showed less invasiveness potential in membranes treated with the media from PRPF8-silenced cells, compared to control cells. Finally, in the third experimental section, the rest of spliceosomal elements and splicing factors were more profoundly analyzed. This analysis showed that the expression of 42% of these spliceosome components and the splicing factors analyzed was significantly deregulated (at mRNA level) in a retrospective cohort of patients with HCC (n = 86), which was quite consistently validated in 7 additional validation cohorts (retrospective or in silico). EIF4A3, RBM3, ESRP2, and SRPK1 were the splicing factors with the highest discrimination capacity (or the highest change value) between tumor and non-tumor samples. Among them, the expression of EIF4A3 was strongly associated with decreased overall survival, greater recurrence, and other clinical characteristics. Furthermore, in vitro silencing of EIF4A3 reduced proliferation, migration, tumor formation, and colonies in three liver cancer cell lines (HepG2, Hep3B, and SNU-387). Similarly, the in vivo silencing of this factor in xerograft tumors established in nude mice reduced the growth of tumors induced by Hep3B cells. In addition, the silencing of EIF4A3 sensitized liver cancer cells (HepG2, Hep3B, and SNU-387) against some drugs used for HCC such as Sunitinib and Lenvatinib, since cell proliferation was more reduced in EIF4A3-silenced cells compared to control cells in response to these drugs. Finally, RNAseq data showed that the silencing of EIF4A3 causes the alteration of the expression and splicing of key genes in HCC, such as FGFR4. In fact, in silico and in vitro studies showed that EIF4A3 is a fundamental factor for the correct splicing of FGFR4 so that the silencing of EIF4A3 alters the splicing pattern of this gene and compromises the cellular response to FGF19, the natural ligand of FGFR4. Therefore, the main conclusions of the work presented in this Thesis are: • The splicing machinery (components of the spliceosome and splicing factors) is drastically dysregulated in HCC and certain components of the spliceosome and splicing factors (EIF4A3, SF3B1, PRPF8, ESRP2, SRPK1, and RBM3) could represent new candidates as possible diagnostic and prognostic biomarkers, as well as therapeutic targets in HCC. • SF3B1 is overexpressed in HCC and could represent a new alternative prognostic biomarker and/or a possible therapeutic target. In this sense, we demonstrate that Pladienolide-B, an inhibitor of SF3B1, altered the expression pattern of oncogenic splicing variants in vitro and in vivo, and reduced malignant characteristics in liver cancer cells, suggesting its potential role as a new target to increase the therapeutic arsenal against HCC. • PRPF8 plays a key role in hepatocarcinogenesis, where it is overexpressed and associated with parameters of aggressiveness and lower survival in patients with HCC. A decrease in PRPF8 expression is associated with less aggressiveness of liver cancer cells in vitro and in vivo and with altered expression and splicing pattern of key cancer-related genes. Specifically, PRPF8 was associated with the migration and invasion capacity of liver cancer cells by modulating FN1 splicing, FAK / AKT signaling, and cytoskeletal remodeling, suggesting the possible use of this new PRPF8-related pathway for the development of more specific tools for the management and treatment of patients with HCC. • EIF4A3 could represent an important novel diagnostic/prognostic and therapeutic target for HCC, since its expression is consistently elevated in HCC samples and it is associated to tumor aggressiveness and patient’s prognosis (survival). EIF4A3 expression modulation altered the capacity to proliferate, migrate and to form colonies/tumorospheres in vitro, and altered the expression and the splicing of key oncogenes in HCC (such as FGFR4) OVERALL CONCLUSION Therefore, the studies presented in this Thesis served to expand and advance in the understanding of the molecular basis of the pathophysiological regulation of HCC through the splicing machinery. Specifically, these results demonstrate that the splicing machinery is profoundly dysregulated in HCC and could represent relevant regulatory points for these tumors and, therefore, could be useful tools for the development of new diagnostic and prognostic biomarkers and/or therapeutic targets (such as SF3B1, PRPF8, ESRP2, SRPK1 or RBM3) to improve the future treatment of this pathology.

El cáncer de hígado representa una patología compleja y heterogénea que engloba varios tipos de tumores malignos con características y pronostico desfavorables, entre los que se encuentra el carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC). El HCC es uno de los tipos de cáncer con peor pronóstico, y mayor incidencia y mortalidad en el mundo. A pesar de la intensa caracterización y los importantes avances realizados en esta patología tumoral gracias a los resultados obtenidos por la investigación durante años, las estrategias diagnósticas y terapéuticas en el HCC no son del todo efectivas. Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar elementos o perfiles moleculares comunes que faciliten estrategias diagnósticas y terapéuticas integrales y efectivas, y que puedan mejorar el pronóstico en esta devastadora patología. En este sentido, hace algunos años se propusieron diez características comunes que comparten la mayoría de tipos de cáncer. Cada una de estas características distintivas del cáncer parece estar asociada con alteraciones concretas en el proceso de splicing, lo que a su vez conduce a un fenotipo de cáncer más agresivo e invasivo. Por ello, el proceso de splicing ha surgido como una alternativa prometedora para la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de diversas patologías metabólicas y numerosos tipos de cáncer, así como una posible fuente para la identificación de posibles dianas terapéuticas en el tratamiento del HCC. El proceso de splicing es catalizado y regulado por una intrincada maquinaria intracelular compuesta por diferentes complejos macromoleculares de ribonucleoproteinas (RNP), llamado spliceosoma y regulado por más de 300 factores de splicing. Estudios recientes han revelado que existe una relación entre la desregulación de esta maquinaria celular y diferentes patologías tumorales. Sin embargo, aún no se conoce con exactitud el papel de los componentes del spliceosoma y los factores de splicing en el desarrollo y/o progresión del HCC. Por todas estas razones, el objetivo principal de esta Tesis fue determinar el grado de desregulación y el posible papel de la maquinaria que controla el proceso de splicing en HCC, así como los mecanismos reguladores subyacentes, con el fin de encontrar nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas con potencial para mejorar los enfoques diagnósticos y terapéuticos en esta patología. Por ello, en primer lugar, se realizó un estudio del perfil de expresión génica de un grupo amplio y representativo de componentes del spliceosoma y factores de splicing que permitió observar una profunda desregulación de esta maquinaria en HCC. Un análisis más profundo por VIP Score (PLS-DA) mostro cambios de expresión relevantes entre tejido tumoral y tejido adyacente no tumoral de elementos clave para el funcionamiento del spliceosoma como SF3B1 o PRPF8 y de otros factores importantes como KHDRBS3, ESRP2, EIF4A3, o SRPK1. Estos resultados nos llevaron a estudiar más en profundidad la desregulación y el papel de SF3B1 y PRPF8 debido a la existencia de fármacos dirigidos a estos factores, su importancia en el funcionamiento del spliceosoma y/o su papel en otras patologías. Así, la primera sección experimental de esta Tesis tuvo como objetivo estudiar el papel de SF3B1 (splicing factor 3 subunit 1) en HCC, con el fin de explorar su potencial como biomarcador y/o diana terapéutica en esta patología. En primer lugar, los análisis de expresión revelaron que SF3B1 está sobreexpresado (a nivel de ARN y proteína) en HCC en dos cohortes retrospectivas y en cinco cohortes in silico, y que su expresión está asociada con la agresividad tumoral, la expresión de variantes de splicing oncogenico (KLF6-SV1, BCL -XL) y la disminución de la supervivencia general de los pacientes. De hecho, in vitro, el silenciamiento de SF3B1 redujo la viabilidad, la proliferacion y la migracion celular y su bloqueo farmacológico con pladienolide-B inhibió la proliferación, migración y formación de tumorosferas y colonias en las tres líneas celulares de cáncer de hígado usadas (HepG2, Hep3B, SNU-387), mientras que los efectos sobre la proliferación de la línea celular derivada de hepatocitos normales (THLE-2) fueron imperceptibles. Pladienolide-B también redujo el crecimiento in vivo y la expresión de marcadores tumorales en tumores xenógrafos inducidos por células Hep3B en ratones atímicos. Además, el silenciamiento y/o bloqueo de SF3B1 modulo la activación de vías de señalización clave (PDK1, GSK3b, ERK, JNK, AMPK), y la expresión de genes asociados al cáncer (CDK4, CD24), así como variantes de splicing oncogénicas (KLF6-SV1). En la segunda sección experimental de esta Tesis nuestro objetivo fue estudiar la desregulación de la expresión de PRPF8 y su posible papel funcional en el HCC. Primero, se analizó la expresión de PRPF8 (a nivel de ARNm / proteína) en una cohorte retrospectiva de pacientes con HCC [y se validó en dos cohortes in silico (TCGA y CPTAC)]. Los resultados indicaron que PRPF8 se sobreexpresa en HCC y se asocia con una mayor agresividad tumoral (supervivencia del paciente, etc.), con la expresión de variantes de splicing de HCC y la modulación de genes críticos implicados en vías relacionadas con el cáncer. El silenciamiento de PRPF8 redujo la agresividad in vitro y disminuyo el crecimiento tumoral in vivo. Los datos de CLIPseq en HepG2 demostraron que PRPF8 se une preferentemente a exones de genes que codifican proteínas, y análisis de RNAseq mostro que el silenciamiento de PRPF8 altera los eventos de splicing de múltiples genes. El análisis integrado revelo que el silenciamiento de PRPF8 modula el splicing de fibronectina (FN1), lo que promueve la exclusión del exón 40.2, que es fundamental para que la FN1 pueda unirse a las integrinas. En concordancia con esto, el silenciamiento de PRPF8 redujo la fosforilación de FAK/AKT y la formación de fibras de estrés. De hecho, las células HepG2 y Hep3B mostraron una menor capacidad invasiva en las membranas tratadas con medios de células silenciadas con siPRPF8, en comparación con las células control. Por último, en la tercera sección experimental se analizó más en profundidad el resto de factores. Este análisis mostro que la expresión del 42% de los componentes del spliceosoma y factores de splicing analizados estaba significativamente desregulada (a nivel de ARNm) en la cohorte retrospectiva de pacientes con HCC (n=86), lo que se validó, de manera muy consistente en 7 cohortes adicionales (retrospectivas o in silico). Concretamente, EIF4A3, RBM3, ESRP2 y SRPK1 fueron los factores de splicing con mayor capacidad de discriminación (o mayor valor de cambio) entre muestras tumorales y no tumorales. De ellos, la expresión de EIF4A3 fue la que presento una asociación más solida con la disminución de la supervivencia general, una mayor recurrencia y con otras características clínicas. Además, el silenciamiento de EIF4A3 in vitro redujo la proliferación, la migración, la formación de tumores y colonias en tres líneas celulares de cáncer de hígado (HepG2, Hep3B y SNU-387). De igual forma, el silenciamiento in vivo de este factor en tumores xenógrafos establecidos en ratones atímicos redujo el crecimiento de tumores inducidos por células Hep3B. Por otro lado, el silenciamiento de EIF4A3 sensibilizo a las células de cáncer de hígado (HepG2, Hep3B y SNU-387) frente a algunos fármacos utilizados para el HCC como Sunitinib y Lenvatinib, ya que la proliferación celular se redujo más en las células con silenciamiento de EIF4A3 que en las celulas control en respuesta a estos fármacos. Finalmente, los datos de RNAseq mostraron que el silenciamiento de EIF4A3 provoca la alteración de la expresión y el splicing de genes clave en el HCC, como FGFR4. De hecho, estudios in silico e in vitro demostraron que EIF4A3 es un factor fundamental para el correcto splicing de FGFR4, de manera que el silenciamiento de EIF4A3 alteran el patrón de splicing de este gen y compromete la respuesta celular a FGF19, el ligando natural de FGFR4. Por todo lo anterior, las principales conclusiones del trabajo presentado en esta Tesis son: • Los componentes del spliceosoma y factores de splicing se encuentran drásticamente desregulados en HCC y ciertos componentes del spliceosoma y factores de splicing (EIF4A3, SF3B1, PRPF8, ESRP2, SRPK1 y RBM3) podrían representar nuevos candidatos como posibles biomarcadores de diagnóstico y pronostico, así como dianas terapéuticas en el HCC. • SF3B1 se sobreexpresa en HCC y podría representar un nuevo biomarcador de pronóstico y/o una posible diana terapéutica. En este sentido, demostramos que el pladienolide-B, un inhibidor de SF3B1, altera el patrón de expresión de las variantes de splicing oncogénicas in vitro e in vivo, y reduce las características de malignidad en las células de cáncer de hígado, lo que sugiere su papel potencial como una nueva diana terapéutica en HCC. PRPF8 tiene un papel clave en la hepatocarcinogénesis, donde se sobreexpresa y asocia con parámetros de agresividad y menor supervivencia en pacientes con HCC. Una disminucion en la expresión de PRPF8 se asocia con una menor agresividad de las células de cáncer de hígado in vitro e in vivo, y con una expresión alterada y un patrón de splicing de genes clave relacionados con el cáncer. Específicamente, PRPF8 está asociado a la capacidad de migración e invasión de las células de cáncer de hígado mediante la modulación del splicing de FN1, la señalización de FAK/AKT y la remodelación del citoesqueleto, lo que sugiere el posible uso de esta nueva vía relacionada con PRPF8 para el desarrollo de herramientas más específicas para el manejo y tratamiento de pacientes con HCC. • EIF4A3 podría representar un importante elemento diagnostico/pronostico y terapéutico para el HCC, ya que su expresión esta consistentemente elevada en muestras de HCC y su expresión se asocia a la agresividad tumoral y al pronóstico (supervivencia) de los pacientes. Además, la modulación de su expresión altero la capacidad de proliferar, migrar y formar colonias/tumorosferas in vitro y modulo la expresión y el splicing de oncogenes clave (como FGFR4) en el HCC. CONCLUSIÓN GLOBAL Por todo lo indicado, los estudios desarrollados en la presente Tesis permiten ampliar y avanzar en el conocimiento de las bases moleculares de la regulación fisiopatológica del HCC a través del estudio de la maquinaria de splicing. Específicamente, nuestros resultados demuestran que esta maquinaria celular esta desregulada en el HCC y podría representar puntos de regulación relevantes para estos tumores y, por lo tanto, podrían ser herramientas útiles para el desarrollo de nuevos biomarcadores de diagnóstico, pronostico y/o dianas terapéuticas (como EIF4A3, SF3B1, PRPF8, ESRP2, SRPK1 o RBM3) para mejorar el tratamiento futuro de esta patología.