Role of human Peroxiredoxin 6 (PRDX6) in proliferation, migration, and invasiveness of hepatocarcinoma cell lines

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) have been considered toxic waste of cellular metabolism and enzymatic activities. However, nowadays it is well-known their tight regulation and the wide range of specific targets that they have in biological systems. Mainly, ROS are responsible for reversible oxidative modifications in proteins leading to appropriate cell signaling in aerobic cells. ROS balance, between production and removal by antioxidant cellular defense, is maintained under normal conditions, for the correct functionality of cellular processes. However, uncontrolled production of ROS generates oxidative stress, one of the main factors involved in cancer disease. Tumorigenesis is described as the gaining of malignant properties which dysregulate cell signaling maintaining a sustained proliferation, evading cell death, and doting cells with new characteristics. Tumoral cells can reactivate the developmental epithelium-mesenchymal transition (EMT) process, and it is here when tumoral cells carry out the “cadherin switch”, gain motility capacity and develop extracellular matrix degrader properties through metalloproteinases (MMP) resulting in metastasis. It is widely assumed that malignant cells exhibit higher levels of ROS than normal cells, contributing to all these protumoral properties. Surprisingly, these uncontrolled levels of ROS that are harmful to normal cells do not have cytotoxic effects on tumor cells but instead lead to exacerbated cell signaling. This is only possible due to the increase of antioxidants in tumoral cells that not only controls the exacerbated induction of ROS but allow to achieve protumorigenic signaling and at the same time avoid cell death. In fact, the antioxidant master regulator NRF2 is a potential contributor to all described cancer hallmarks. Consequently, downregulation of antioxidant defenses has been postulated as a very promising antitumor strategy in cancer, alone or in combination with conventional treatments. Peroxiredoxins are important enzymes of cellular antioxidant defense whose function consists of reducing H2O2, peroxynitrite, and alkyl hydroperoxides. Within them, PRDX6, through its peroxidase activity, is the only one that also reduces phospholipids hydroperoxides derived from lipid peroxidation. Moreover, PRDX6 through its calcium independent phospholipase A2 (aiPLA2) and lisophosphatidylcholine acyl transferase (LPCAT) activities is involved in repairing cell membranes. In addition, PRDX6 is overexpressed in cancer cells. Although its role in tumors remains unclear, PRDX6 seems to protect against cytotoxic effects of ROS as well as contribute to the synthesis of some tumoral-related lipokines. Moreover, PRDX6 is described to support prooxidant activity of NOX1 whose effects seem to be related to the malignant phenotype of certain tumoral cells. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common type of primary liver cancer, sorafenib and other drugs represent the only treatment at advanced stages, but they have reduced effects since hepatoma cells rapidly acquire resistance to these drugs leading to the urgent necessity of finding new therapeutic options. The aim of this thesis is to decipher protumoral functions of PRDX6 in HCC using epithelioid HepG2 and mesenchymal SNU475 cell lines. For that, cells were knocked out for PRDX6 through CRISPR/Cas9 technology. Moreover, PRDX6 was overexpressed in conjunction with NOX1 system in SNU475 cells to explore the malignant effects of this partnership in HCC. After PRDX6 removal, both cell lines showed a redox status disruption, increased ROS, lack of NRF2 induction and lower Grx1 levels. Redox proteomic analysis detected 218 peptides more oxidized and 36 more reduced in HepG2 cells after PRDX6 deprivation. Among them, the two extra cysteines of Grx1, Cys79 and Cys83 were more oxidized in knockout cells which can have drastic consequences for Grx1 activity. In both cell lines, Seahorse analysis showed impaired mitochondrial and glycolytic functionality when PRDX6 was absent, leading to metabolic reprogramming. Furthermore, a decreased proliferative rate without apoptotic effects was exhibited in those cell lines. Interestingly, cell cycle studies identified a G2/M arrest as the cause of slow proliferation in the absence of PRDX6, with involvement of PCNA and GSK3b. The proliferation protein PCNA was repressed in HepG2PRDX6-/- or SNU475PRDX6-/- cell lines by oxidative changes or by lower expression, respectively. Importantly, SNU475PRDX6-/- cells presented a GSK3b inactivation in Ser9 produced by phosphorylation of AKT. Successfully, these PCNA levels and GSK3b activation were recovered once PRDX6 was again present in SNU475PRDX6-/- cell line. The malignant phenotype was also affected since both knockout cells presented a reduced expression of EMT markers through the “cadherin switch”. Additionally, SNU475 cells exhibited repressed intracellular and extracellular MMP2 enzymatic activities with lower migratory and invasive capacities after PRDX6 deficiency. The malignant effects of prooxidant capacity of PRDX6 through NOX1 were also evaluated in SNU475 cell line. Surprisingly, PRDX6 supported NOX1 activity through a possible stabilization of NOXA1 component. Thus, PRDX6 main activities, phospholipase and peroxidase, were essential to generate higher NOX1-ROS derived production which actively contributed to an increased expression of EMT markers, migratory and invasive capacities in SNU475 cells. All these changes supported the role of PRDX6 in tumor development that was demonstrated in xenograft models since its absence reduced the tumor formation capacity of these HCC cell lines. Consequently, these results point to PRDX6 as a good candidate for antitumoral strategies. In fact, preliminary data from the use of specific miRNA against PRDX6 contained in nanoliposomes showed lower tumoral formation capacity of HepG2 cells in xenograft models. Thus, this strategy of targeting PRDX6 in vivo could be a very promising antitumoral treatment alone or in presence of drugs as sorafenib in HCC patients.

Las especies reactivas de oxígeno (EROS) han sido consideradas el desecho tóxico del metabolismo celular y de diversas actividades enzimáticas. Sin embargo, recientemente se han identificado las múltiples dianas que estas especies coordinan y su estricta regulación en sistemas biológicos. Principalmente, EROS son responsables de modificaciones oxidativas en las proteínas las cuales son esenciales para señalización celular en células aeróbicas. El equilibrio de EROS entre su producción y su eliminación por los sistemas antioxidantes es mantenido bajo condiciones celulares normales y posibilita el correcto funcionamiento de procesos celulares. Sin embargo, una producción descontrolada de EROS genera estrés oxidativo, uno de los principales factores implicados en la enfermedad del cáncer. El proceso tumorigénico es descrito como una ganancia de características malignas las cuales desregulan la señalización celular incrementando proliferación, evadiendo muerte celular y dotando a células tumorales con nuevas características. Estas células pueden reactivar el proceso de transición epitelio-mesénquima (TEM) esencial para el desarrollo del organismo. Así que aquí es cuando las células tumorales llevan a cabo “el cambio en cadherinas”, ganan motilidad y desarrollan propiedades de degradación de matriz extracelular a través de metaloproteinasas (MMP) lo cual genera metástasis. Se conoce que las células malignas de cáncer poseen mayores niveles de EROS que células con un fenotipo normal ya que esto contribuye a la generación de cualidades protumorales. Sorprendentemente, estos descontrolados niveles de EROS que son dañinos para las células normales no conllevan efectos citotóxicos en células tumorales y participan en una activación de múltiples cascadas de señalización. Esto es solo posible debido a un incremento de antioxidantes en células tumorales controlando EROS y permitiendo alcanzar señalización protumorigénica y al mismo tiempo impidiendo la muerte celular. De hecho, el gran regulador de la defensa antioxidante NRF2 es descrito como un potencial contribuidor a todas las cualidades relacionadas con el fenotipo tumoral. Por tanto, la represión de estos sistemas de defensa antioxidante ha sido planteada como una estrategia antitumoral muy prometedora en cáncer y también en combinación con los tratamientos convencionales. Peroxirredoxinas son enzimas importantes en la defesa antioxidante celular cuya función consiste en la reducción de H2O2, peroxinitrito e hidroperóxidos acilados. Dentro de ellas se encuentra PRDX6 que a través de su actividad peroxidasa es la única que reduce hidroperóxidos de fosfolípidos derivados de peroxidación lipídica. Además, PRDX6 a través de sus actividades fosfolipasa A2 independiente de calcio (aiPLA2) y lisofosfatidilcolina acil transferasa (LPCAT) está involucrada en la reparación de membranas celulares. PRDX6 está sobreexpresada en cáncer. Aunque su papel en esta enfermedad queda aún por descifrar, PRDX6 protege contra efectos citotóxicos de EROS y contribuye en la síntesis de lipoquinas protumorales. Además, PRDX6 participa en la actividad prooxidante de NOX1 cuyos efectos parecen estar relacionados con la capacidad metastásica de ciertas células tumorales. El carcinoma hepatocelular (CHC) es el tipo más común entre los cánceres de hígado primarios donde sorafenib y otros fármacos representan los únicos tratamientos disponibles en estadios avanzados, pero cuentan con efectos reducidos ya que las células tumorales hepáticas rápidamente adquieren resistencia a estos fármacos lo cual muestra la necesidad urgente de encontrar nuevas opciones terapéuticas. El propósito de esta tesis es descifrar funciones protumorales de PRDX6 en CHC usando las líneas celulares epitelioide HepG2 y mesenquimal SNU475. Para ello, PRDX6 fue eliminada de estas líneas utilizadas a través de la metodología CRISPR/Cas9. Además, PRDX6 fue sobreexpresada en conjunción con el sistema NOX1 en células SNU475 para explorar los efectos metastásicos de esta asociación de proteínas en CHC. Después de la eliminación de PRDX6, ambas líneas celulares mostraron una disrupción del estatus redox celular, incrementaron los niveles de EROS, sin una inducción de NRF2 y los niveles de Grx1 fueron más bajos. El análisis del proteoma redox detectó 218 péptidos más oxidados y 36 más reducidos en células HepG2 después de la ausencia de PRDX6. Entre ellos, las dos cisteínas extras de Grx1, Cys79 y Cys83, que estuvieron más oxidadas lo cual puede tener consecuencias drásticas para la actividad de Grx1. En ambas líneas celulares sin PRDX6, el análisis “Seahorse“ mostró disfunción mitocondrial y glucolítica resultando en una reprogramación metabólica. Además, la eliminación de PRDX6 conllevó una disminución en proliferación celular sin efectos apoptóticos en ambas líneas celulares. Estudios de ciclo celular identificaron una parada en G2/M como la causa de proliferación ralentizada en ausencia de PRDX6 donde proteínas como PCNA y GSK3b podrían estar involucradas. La proteína de proliferación PCNA fue reprimida en las líneas celulares HepG2PRDX6-/- y SNU475PRDX6-/- por cambios oxidativos o por una expresión más baja, respectivamente. Las células SNU475PRDX6-/- presentaron una inactivación de GSK3b a través de la fosforilación de su residuo Ser9 producido por fosforilación de AKT. Estos niveles de PCNA y la activación GSK3b fueron recuperados de forma exitosa una vez que PRDX6 estuvo presente otra vez en la línea celular SNU475PRDX6-/-. El grado de malignidad de ambas líneas tumorales fue también afectado con la falta de PRDX6 presentando una reducida expresión de marcadores del proceso TEM a través del “cambio en cadherinas”. Adicionalmente, la línea celular SNU475 mostró una represión intracelular y extracelular de la actividad enzimática de MMP2 con bajas capacidades migratorias e invasivas después de la eliminación de PRDX6. Los efectos metastásicos de la actividad prooxidante de PRDX6 a través de NOX1 fueron también evaluados en la línea celular SNU475. Sorprendentemente, PRDX6 incrementó la actividad del sistema NOX1 a través de un posible mecanismo de estabilización del componente NOXA1. También se observó que las principales actividades de PRDX6, fosfolipasa y peroxidasa, fueron esenciales en la generación de EROS derivadas de NOX1 lo cual contribuyó activamente a un incremento de la expresión de marcadores del proceso TEM y las capacidades migratorias e invasivas de las células SNU475. Todos estos cambios apoyaron el papel de PRDX6 en el desarrollo tumoral lo cual fue demostrado en modelos de ratón a través de xenoinjertos ya que su ausencia redujo la capacidad de formación tumoral de estas líneas celulares en dichos modelos. Como consecuencia, estos resultados apuntan a PRDX6 como un buen candidato en estrategias antitumorales. De hecho, datos preliminares del uso de microARNs específicos contra PRDX6 encapsulados en nanopartículas mostraron una menor capacidad de formación tumoral de células HepG2 en dichos modelos de ratón. De este modo, esta estrategia contra los niveles de PRDX6 in vivo podría servir como un tratamiento antitumoral bastante prometedor o también combinando sus efectos con sorafenib en pacientes de CHC.