Caracterización del riesgo aterotrombótico en pacientes con síndrome antifosfolípido mediante análisis transcriptómicos

Abstract

Introducción: Estudios previos han demostrado que múltiples mecanismos pueden conducir al desarrollo de trombosis y aterosclerosis en pacientes con SAF, incluyendo el efecto sinérgico de autoanticuerpos y moléculas protrombóticas, receptores de adhesión, mediadores inflamatorios y diversas moléculas de señalización intracelular. Asimismo, en los últimos años se han producido importantes avances en la comprensión de las bases moleculares de la aterotrombosis en el SAF. No obstante, aún se desconoce la relación entre los cambios ocurridos en los perfiles transcriptómicas de los monocitos de pacientes SAF, la presencia/títulos de autoanticuerpos y las manifestaciones clínicas. El análisis integrado a nivel transcriptómico entre la expresión génica (mRNA) y sus reguladores negativos, los microRNAs (miRNAs), podría identificar nuevas redes de interacción moleculares subyacentes al desarrollo de enfermedad cardiovascular (ECV) en pacientes con SAF que contribuya al desarrollo de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas futuras. Objetivo: Caracterizar fenotipos clínicos distintivos en pacientes con síndrome antifosfolípido (SAF) mediante el análisis integrado en plasma y monocitos de perfiles transcriptómicos e inflamatorios. Pacientes y Métodos: Monocitos de sangre periférica de 40 pacientes SAF y 40 donantes sanos (DS) se purificaron mediante selección inmunomagnética negativa. El análisis del transcriptoma y el miRNoma a partir de ARN total se realizó utilizando las plataformas Agilent G4112F y nCounter (Nanostring) respectivamente. Mediante el software IPA se realizó un análisis integrado entre los miRNAS y genes diferencialmente expresados que presentaban complementariedad en su secuencia como potenciales dianas. La red de interacción RNAm-miRNA identificada se analizó en una cohorte paralela de pacientes trombóticos no autoinmunes. Se evaluaron perfiles inflamatorios y CV en plasma mediante ensayos multiplex; la fosforilación de proteínas intracelulares se analizo mediante array PathScan. En paralelo se realizó un estudio clínico/analítico exhaustivo. In vitro, monocitos de DS se incubaron con AAF-IgG purificados y se evaluó su efecto sobre la expresión de genes/microARNs alterados. Resultados: El análisis de microarrays en monocitos SAF identifico 547 genes diferencialmente expresados, implicados en trastornos inflamatorios, cardiovasculares (CV) y reproductivos, así como en patología renal y dermatológica. Análisis paralelos de activación de rutas intracelulares mostraron fosforilación de quinasas asociadas a trombosis e inflamación. El estudio del miRNoma revelo la expresión alterada de 22 microARNs, implicados en vías moleculares relacionadas con respuesta inmune y enfermedad cardiovascular (ECV). La integración molecular del transcriptoma y el miRNoma identifico una firma de 9 microARNs como moduladores potenciales de 17 genes. Dicha firma molecular se mostró estable en el tiempo y distinta de la identificada en una cohorte de pacientes trombóticos no autoinmunes. Estudios de transfección y ensayos de luciferasa establecieron la interrelación entre microARNs y sus genes diana, así como su implicación en la regulación de la actividad procoagulante y la adhesión celular en monocitos. Los estudios in vitro demostraron la modulación por AAF-IgG en monocitos de varios genes y microARNs, los cuales mediaron los efectos de dichos autoanticuerpos sobre la función endotelial. La firma molecular identificada permitió la clasificación no supervisada de los pacientes SAF en 3 clústeres con perfiles clínicos distintivos. Así, en el clúster 1 se encontraban los pacientes con mayor alteración de la firma de genes y miRNAs identificados y mostraban una mayor incidencia de factores de riesgo CV, presencia de placas de ateroma y prevalencia de autoanticuerpos. Por el contrario, el clúster 3 englobaba a los pacientes con menor alteración de la firma molecular, caracterizados por una reducida prevalencia de factores de riesgo CV, menor incidencia de placas de ateroma y baja positividad para AAF. El clúster 2 caracterizaba a un grupo de pacientes con alteración clínico-molecular intermedia. Los citados perfiles se observaron asimismo paralelos a la presencia de patrones específicos de expresión de mediadores inflamatorios y CV en plasma. Conclusiones: En su conjunto, el presente estudio demuestra que el análisis del perfil molecular obtenido con tecnologías de alto rendimiento y herramientas bioinformáticas avanzadas, en combinación con una caracterización clínica exhaustiva, constituye una aproximación experimental que permite identificar fenotipos clínicos relevantes distintivos, lo que podría favorecer en el futuro un manejo mas personalizado de estos pacientes.