Papel de la homeostasis del cobre en la patogénesis fúngica

Abstract

In fungi, copper acquisition is mainly carried out by specific high-affinity systems consisting of Fre metalloreductases and Ctr copper transporters, which are transcriptionally activated under copper limiting conditions by the copper-sensing transcription factor Mac1. Mac1 is required for full virulence in several animal pathogenic fungi, but its role in phytopathogenic fungi has not been described so far. In this work we show that Mac1 controls the transcriptional response of the vascular wilt pathogen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici to copper limitation and that it is essential for growth under copper limiting conditions and for virulence on tomato plants. Importantly, simultaneous overexpression of the high-affinity copper transporter ctr3 and the metalloreductase fre9 in a mac1Δ background restored growth under copper limitation and pathogenicity, indicating that the main role of Mac1 during infection is to ensure efficient copper acquisition. Because inactivation of Mac1 in F. oxysporum leads to increased sensitivity to oxidative stress and reduced virulence, we studied the role of superoxide dismutases (SODs), a class of copper-dependent enzymes that are relevant for pathogenicity in other fungi. We found that the two SODs of F. oxysporum that use copper as a cofactor, Sod1 and Sod5, play a role in the pathogenicity. Although the activity of Sod5 could not be detected in our in vitro assays, the enzymatic activity of Sod1 was reduced in mac1Δunder copper-limiting conditions, suggesting that failure to activate Mac1-dependent high-affinity copper acquisition could lead to reduced activity of copper-dependent SODs and explain the virulence phenotype of the mac1Δ mutant. On the other hand, the response to oxidative stress in F. oxysporum was previously shown to be controlled by the Mpk1 mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway. This MAPK cascade regulates cell wall integrity and is involved in virulence-related processes that are also controlled in parallel by the Fmk1 MAPK pathway, but the downstream components that mediate these diverse functions are largely unknown. Here we find that expression of the GATA-type transcription factor Pro1 is regulated at least in part, by the Mpk1 and Fmk1 MAPK pathways, as well as by other signalling components such as the Velvet regulatory complex and the signaling protein Soft (Fso1). We further show that Pro1 controls a subset of functions downstream of Mpk1 including quorum sensing, hyphal fusion and chemotropism, whereas it is dispensable for other processes such as invasive hyphal growth, response to cell wall stress or virulence.

En hongos, la adquisición de cobre se lleva a cabo principalmente mediante sistemas específicos de alta afinidad compuestos por las metaloreductasas Fre y los transportadores de cobre Ctr, que son activados transcripcionalmente en condiciones limitantes de cobre por el factor de transcripción sensor de cobre Mac1. Mac1 es necesario para la virulencia completa de varios hongos patógenos de animales, pero su papel en hongos fitopatógenos no se ha descrito hasta ahora. En este trabajo demostramos que Mac1 controla la respuesta transcripcional a la limitación de cobre en Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, y que es esencial para el crecimiento en esta condición, así como para la virulencia en plantas de tomate. Además, la sobreexpresión del transportador de cobre de alta afinidad ctr3 y de la metaloreductasa fre9 en la cepa mac1Δ restaura el crecimiento en condiciones limitantes de cobre y la patogenicidad, lo que indica que la adquisición eficiente de cobre es la principal función de Mac1 durante la infección de F. oxysporum. Ya que la inactivación de Mac1 en F. oxysporum causa una mayor sensibilidad al estrés oxidativo y una reducción en la virulencia, hemos estudiado su papel en la actividad superóxido dismutasa (SOD), una clase de enzimas dependientes de cobre cuya relevancia en la patogenicidad ha sido demostrada en otros hongos. Nuestros resultados revelan que las dos SODs de F. oxysporum que utilizan cobre como cofactor (Sod1 y Sod5) participan en la patogenicidad. Aunque la actividad de Sod5 no pudo detectarse en nuestros ensayos, en el mutante mac1Δ la actividad enzimática de Sod1 se redujo en condiciones limitantes de cobre. Por lo tanto, el fenotipo de virulencia de mac1Δ en F. oxysporum podría explicarse por la actividad reducida de las SODs dependientes de cobre debida a la falta de activación de los mecanismos de adquisición de cobre dependientes de Mac1. Por otro lado, la respuesta al estrés oxidativo está controlada por la ruta de señalización de la proteína kinasa activada por mitógenos (MAPK) Mpk1. Esta MAPK controla la integridad de la pared celular y está implicada en procesos relacionados con la virulencia que están controlados en paralelo por la ruta MAPK Fmk1. Los componentes que median esta regulación aguas abajo de la MAPK son desconocidos. En este estudio descubrimos que la expresión del factor de transcripción de tipo GATA Pro1 está regulada, al menos en parte, por las rutas MAPK Mpk1 y Fmk1. Además, Pro1 controla un subconjunto de funciones dependientes de estas MAPKs, como la detección de quórum, la fusión de hifas y el quimiotropismo, mientras que es prescindible para otros procesos como el crecimiento invasivo de hifas o la respuesta al estrés de la pared celular.