Degradación de compuestos nitroaromáticos por Rhodobacter: purificación de la nitrorreductasa Npr

Abstract

El gen nprB de R. capsulatus B10S codifica una nitrorreductasa que presenta similitud con miembros de la familia B de las nitrorreductasas insensibles a oxígeno. Asimismo, NprB también muestra cierta similitud, aunque no muy elevada, con la nitrorreductasa NprA de R. capsulatus que ha sido estudiada previamente. La proteína NprB se ha sobreexpresado en células de E. coli fusionada a una cola de polihistidinas, y se ha purificado por cromatografía de afinidad. La proteína recombinante purificada posee actividad con diferentes compuestos nitroaromáticos y heterocíclicos utilizados por otras nitrorreductasas, y puede utilizar como sustrato 2,4,6–trinitrotolueno (TNT), aunque la máxima actividad se obtiene con ácido pícrico (2,4,6–trinitrofenol). Sin embargo, la proteína NprB no puede activar eficazmente al profármaco CB1954 utilizado en terapias antitumorales. La proteína purificada contiene FMN y utiliza preferentemente NADH como donador de electrones. Además, se inhibe por dicumarol y capsaicina, así como por cianuro y sulfato de cobre. La proteína NprB posee una baja actividad dihidropterina reductasa, a diferencia de NprA, pero fisiológicamente podría actuar como una NAD(P)H–quinona oxidorreductasa. Finalmente, se han obtenido varios posibles mutantes por inserción al azar del transposón Tn5 que podrían estar afectados en la ruta degradativa del 2,4–dinitrofenol (DNP) en R. sphaeroides DSM158S. La caracterización de estos mutantes podrá permitir dilucidar la ruta degradativa del DNP en esta bacteria, e identificar los principales genes e intermediarios metabólicos implicados en el proceso.