Novel RNAi and CRISPR/Cas approaches for developing immunologic-safe cereal varieties

Abstract

Among cereal species, wheat stands out for its unique bread-making properties. Wheat gliadins and glutenins, commonly known as gluten, are primarily responsible for these viscoelastic properties of wheat dough. However, gluten is also responsible for triggering several human pathologies, being celiac disease (CD) the most studied. CD is a chronic enteropathy in genetically predisposed individuals, affecting 1% of the global population. Besides CD, other wheat-related pathologies, such as allergies, have been described. Wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WDEIA) is one of the most severe forms of wheat allergy. This condition occurs in patients who engage in physical activity after consuming wheat-containing foods. Currently, the only available treatment for those suffering from gluten-related pathologies is adhering to a gluten-free diet (GFD) for life. To improve the quality of life for these patients, wheat lines with reduced gliadin content have been developed employing genetic engineering technologies such as RNA interference (RNAi) to silence genes. However, their effectiveness has yet to be fully confirmed in patients. The second chapter of this thesis aimed to determine whether the consumption of bread made from flour of a wheat RNAi line with low gliadin content, named E82, could trigger an immune response in DQ2.5 positive celiac patients. For this purpose, an oral gluten challenge pilot trial was conducted, assessing the gastrointestinal symptoms of patients, interferon-γ (IFN-γ) production by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and measuring gluten immunogenic peptides (GIPs) in stool samples. Consumption of standard bread containing gluten by CD patients elicited a significant response in their PBMCs, while consumption of E82 bread did not elicit such a response. This lack of immune response was correlated with the fact that after consuming E82 bread, stool samples from CD patients showed low levels of GIPs, and their gastrointestinal symptoms were comparable to those on a GFD. This pilot study is the first to prove that bread made using flour from an RNAi wheat line with very low gliadin content does not trigger an immune response after a shortterm oral challenge and could help manage GFD in celiac patients. In the third chapter of this thesis, we evaluated the reactivity of protein extracts from several low-gliadin RNAi wheat lines in sera from patients with WDEIA. Firstly, we characterized these RNAi lines' gliadin and glutenin content through high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis. Then, we performed western blot assays to determine the reactivity of immunoglobulin E (IgE) to the wheat proteins in sera from five WDEIA patients. Finally, we searched and quantified for antibody recognition sites and IgE binding sites in all peptides identified by LC-MS/MS after protein digestion using gastric enzymes. Our results showed that the RNAi lines had a reduction from 61.4% to 81.2% in the gliadin content and an increase in their high molecular weight (HMW) glutenin content compared to the wild type. In all cases, the reduction in gliadin content correlated with a decrease in IgE reactivity observed in the sera of WDEIA patients. The E82 and H320 lines stood out as they showed a reduction of ≤90% in IgE reactivity. This reduction could be attributed to the absence of IgE binding sites associated with strong reduction in the content of α- and ω5-gliadins. In contrast, high IgE, high number of IgE binding sites and high content of α- y ω5-gliadins were present in the wild-type. Therefore, these lines could be a promising alternative for individuals with WDEIA. In addition to RNAi, the CRISPR/Cas technology has also been used to produce edited lines of bread and durum wheat to produce wheat lines with reduced α- gliadin content. This technology does not involve the insertion of transgenes into the final product; therefore, the developed lines likely have better consumer acceptance. However, analyzing the insertions and deletions (InDels) patterns produced in these lines by CRISPR/Cas is challenging. This is because the α-gliadin genes have multiple high homology copies, arranged in tandem and located on the A, B, and D subgenomes. In the fourth chapter, we addressed this challenge by developing a novel bioinformatic tool for the analysis of InDels in the α-gliadin genes edited with two single guide RNAs (sgRNA). The bioinformatic workflow is based on the nextgeneration (NGS) amplicon sequencing that allows the identification of amplicons containing InDels and the analysis of these through the comparison with the most similar parental sequence. To achieve this a trimmed mean of M-values normalization (TMM) was first carried out to enable comparisons between samples, therefore allowing the study of the abundance of each InDel and its heritability. Thus, the developed workflow enables a rapid characterization of mutations in multigene families. The resulting workflow is also helpful in identifying possible genomic rearrangements, such as large deletions caused by Cas9 cleavage activity. Despite the efforts made, the RNAi and CRISPR lines developed so far contain more than 20 ppm of gluten and would not fall into the category of gluten-free foods. This led us to initiate a new research line to improve the functionality and quality of proteins from other cereals, such as rice, which naturally lack immunogenic gluten. Thus, the objective of the fifth chapter of this thesis was to initiate this new research line to improve the quality and functionality of rice by modifying the composition of its reserve proteins (SSPs) by CRISPR/Cas. To that, we designed three CRISPR/Cas vectors: one for editing the 13 kDa prolamins and two for editing the GluA glutelins. Subsequently, T0 and T1 edited lines were generated and analyzed. Both, sequencing to identify InDels, and protein analysis using SDS-PAGE, Bradford, and HPLC confirmed the editing of the target genes. Regarding InDel analysis, insertions were more frequent than deletions, representing 56% and 74% of targeted mutations in the prolamin and glutelin genes, respectively. Additionally, not all sgRNAs exhibited the same cutting efficiency. On the other hand, SSP profile analysis confirmed that edited lines lacked protein bands associated with GluA glutelins or 13 kDa prolamins. Furthermore, quantification of SSP fractions in edited lines revealed significant alterations compared to control lines. Overall, all edited lines showed an increase in albumin and globulin fractions. However, prolamin lines showed a significant reduction in the prolamin fraction, while glutelin lines showed a significant increase. All lines presented a significantly higher total protein content than the control and presumably higher lysine-rich protein content. These results suggest that gene editing of specific fractions of SSPs causes a rebalancing of rice proteins, which we can use at a second step to improve the functionality and nutritional quality of rice.

El trigo destaca por sus características harino-panaderas, únicas entre las especies de cereales. El gluten de trigo, compuesto por gliadinas y gluteninas, es el principal responsable de estas propiedades viscoelásticas de la masa. No obstante, el gluten de trigo también es responsable de diversas patologías humanas, siendo la enfermedad celiaca (EC) la más estudiada de ellas. La EC es una enteropatía crónica que se desarrolla en individuos genéticamente predispuestos que afecta al 1% de la población mundial. Además de la EC, existen otras patologías relacionadas con el consumo de trigo como las alergias. La anafilaxia inducida por ejercicio dependiente del trigo (WDEIA, por sus siglas en inglés) es una de las formas más graves de alergia al trigo. Esta enfermedad tiene lugar en pacientes que incurren en actividad física después de ingerir alimentos elaborados con harina de trigo. En la actualidad, el único tratamiento disponible para quienes padecen estas patologías es adoptar una dieta sin gluten (DSG) durante toda la vida. Con el fin de mejorar la calidad de vida de estos pacientes, se han desarrollado líneas de trigo con un menor contenido en gliadinas, la fracción más inmunogénica del gluten, empleando tecnologías de ingeniería genética como el ARN de interferencia (ARNi) para el silenciamiento específico de genes. Sin embargo, su eficacia aún no ha sido plenamente confirmada en pacientes. El segundo capítulo de esta tesis ha tenido como objetivo determinar si el consumo de pan fabricado con harina de una línea RNAi de trigo con muy bajo contenido en gliadinas, denominada E82, es capaz de activar la respuesta inmune en pacientes celiacos DQ2.5 positivos. Para ello, se ha realizado un ensayo de provocación oral con gluten en el que se evaluaron los síntomas gastrointestinales de los pacientes, la producción de interferón-γ (IFN-γ) por células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y se midieron los péptidos inmunogénicos del gluten (PIG) en muestras de heces. La ingesta de pan estándar con gluten por pacientes con EC provocó una respuesta significativa en sus CMSP, mientras que el consumo de pan E82 no provocó dicha respuesta, lo que estuvo correlacionado con que las muestras de heces de pacientes con EC mostraron niveles muy bajos de PIGs, y sus síntomas gastrointestinales fueron comparables a los de la DSG. Este estudio piloto es el primero en proporcionar evidencias de que el pan fabricado con una harina de trigo RNAi con muy bajo contenido en gliadinas no provoca una respuesta inmunológica. Estos resultados pueden ayudar a gestionar la DSG en pacientes celiacos. El tercer capítulo de esta tesis tuvo como objetivo evaluar la reactividad de extractos proteicos procedentes de líneas de trigo RNAi con bajo contenido en gliadinas en sueros de pacientes con WDEIA. En primer lugar, se caracterizó el contenido en gliadinas y gluteninas de estas líneas RNAi mediante un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). A continuación, se llevaron a cabo ensayos de inmunotransferencia (western blots) para medir la reactividad de la inmunoglobulina E (IgE) a las proteínas del trigo en sueros de pacientes con WDEIA. Finalmente, se identificaron y cuantificaron los sitios de reconocimiento de anticuerpos monoclonales (moAb) y sitios de unión de IgE en todos los péptidos identificados por LC-MS/MS tras la digestión de las proteínas de las líneas RNAi con enzimas gástricas. Los resultados mostraron una reducción del 61.4% al 81.2% en el contenido en gliadinas de las líneas RNAi, acompañada de un incremento en el contenido en las gluteninas de alto peso molecular (HMW) en comparación con la línea de trigo panadero silvestre (WT). En todos los casos, la reducción en el contenido en gliadinas se correlacionó con una disminución en la reactividad de IgE observada en los sueros de pacientes con WDEIA, destacando las líneas E82 y H320. Estas dos líneas RNAi exhibieron una reducción de ≤90% en la reactividad de IgE. Esta reducción podría atribuirse a la ausencia de sitios de unión de IgE asociados con la fuerte reducción en las α- y ω5-gliadinas, que sí estaban presentes en el WT. Estas líneas podrían ofrecer una alternativa para personas con WDEIA. Además de la tecnología RNAi, la tecnología CRISPR/Cas también se ha utilizado para producir líneas editadas de trigo duro y harinero con un menor contenido en α-gliadinas. Esta tecnología no implica la inserción de transgenes en el producto final y, por tanto, las líneas desarrolladas probablemente tengan una mayor aceptación por parte del consumidor final. Sin embargo, el análisis de las inserciones y deleciones (InDels) producidas en estas líneas es complejo debido a que los genes de α-gliadinas presentan múltiples copias de una homología alta que, además, están dispuestas en tándem y localizadas en los subgenomas A, B y D. Por esta razón, en el cuarto capítulo presentamos una novedosa herramienta bioinformática para el análisis de InDels en los genes de α-gliadinas editados con dos ARN guía simples (sgRNA). La técnica se basa en secuenciación de amplicones mediante secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés), lo que permite la identificación de amplicones con InDels y el análisis de estas mediante la comparación con la secuencia parental más similar. Para ello, se llevó a cabo una normalización de medias trucandas de M-valores (TMM, del inglés, Trimmed Mean of M-values) para poder realizar comparaciones entre muestras; pudiendo así estudiar la abundancia de cada InDel y su heredabilidad. El flujo de trabajo desarrollado permite una caracterización rápida de InDels en familias multigénicas. Además, también es útil para identificar posibles reorganizaciones genómicas, como grandes deleciones causadas por la actividad de corte de Cas9. A pesar de los esfuerzos realizados, las líneas RNAi y CRISPR desarrolladas presentan más de 20 ppm de gluten y no entrarían en la categoría de alimentos sin gluten. Ello, nos llevó a iniciar una nueva línea de investigación complementaria para mejorar la funcionalidad y calidad de las proteínas de otros cereales, como el arroz, que naturalmente carecen de gluten inmunogénico. De esta forma, el objetivo del quinto capítulo de esta tesis fue iniciar esta línea de investigación para mejorar la calidad y funcionalidad de arroz modificando la composición de sus proteínas de reserva (SSPs, por sus siglas en inglés) mediante CRISPR/Cas. Para ello, diseñamos tres vectores CRISPR/Cas: uno para editar las prolaminas de 13 kDa y dos para editar las glutelinas GluA. Posteriormente, se generaron y analizaron líneas T0 y T1 editadas. Tanto el análisis de secuenciación para identificar las InDels, como los análisis de proteínas mediante SDS-PAGE, Bradford y HPLC, confirmaron la edición de los genes objetivo y permitieron evaluar los cambios de estas ediciones en la composición de proteínas de almacenamiento. En cuanto al análisis de InDels, las inserciones fueron más frecuentes que las deleciones, representando el 56% y el 74% de las mutaciones dirigidas en los genes de prolaminas y glutelinas, respectivamente. Además, no todos los sgRNA exhibieron la misma eficiencia de corte. Por otro lado, el análisis del perfil de SSPs confirmó que las líneas editadas carecían de bandas proteicas asociadas con las glutelinas GluA o las prolaminas de 13 kDa. La cuantificación de las fracciones de SSP en líneas editadas, también mostró alteraciones significativas en comparación con las líneas control. En general, todas las líneas editadas presentaron un aumento en las fracciones de albúminas y globulinas. Sin embargo, las líneas de prolaminas mostraron una reducción significativa de la fracción de prolaminas mientras que las líneas de glutelinas mostraron un aumento significativo de esta fracción. Todas las líneas presentaron un contenido de proteína total significativamente mayor al control y, presumiblemente, un mayor contenido de proteínas ricas en lisina. Estos resultados sugieren que la edición genética de fracciones específicas de SSPs provoca un rebalanceo de las proteínas de arroz, lo que podemos utilizar en etapas posteriores para mejorar la funcionalidad y calidad nutricional del arroz.