Identificación de proteínas que participan en una ruta de desmetilación activa de DNA en Arabidopsis thaliana

Abstract

DNA methylation (5-methylcytosine, 5-meC) is an important epigenetic mark for transcriptional gene silencing that plays critical roles in regulation of developmental genes, genomic imprinting, X chromosome inactivation and transposon silencing. Methylation landscapes are established by the combined actions of methylation and demethylation reactions. The mechanisms responsible for active DNA demethylation in mammalian cells are still poorly understood. However, in plants there is convincing genetic and biochemical evidence that a subfamily of DNA glycosylases typified by Arabidopsis ROS1 (REPRESSOR OF SILENCING 1) remove 5-meC from DNA, initiating its replacement by unmethylated cytosine through a base excision repair (BER) process. After 5-meC removal, ROS1 and its homologous cleave the phophodiester backbone, generating a substantial fraction of products containing a single-nucleotide gap flanked by 3´- and 5´-phosphate termini. In this work, it has been found that the DNA phosphatase ZDP removes the blocking 3´-phosphate, allowing subsequent DNA polymerization and ligation steps needed to complete demethylation. ZDP and ROS1 interact in vitro and colocalize in vivo in nucleoplasmic foci. It has also been found that extracts from zdp mutant plants are unable to complete DNA demethylation in vitro, and mutations in ZDP cause DNA hypermethylation and transcriptional silencing of a reporter transgene. Furthermore, genome-wide methylation analysis in zdp mutant plants identified hundreds of hypermethylated endogenous loci. Our results also indicate that, besides a role during DNA demethylation, ZDP participates in the repair of DNA damage, probably by processing single-strand breaks (SSB) generated either directly by DNA-damaging agents or indirectly as repair intermediates. This work also examined the possible role of plant XRCC1 (X-ray cross complementing group protein 1) in DNA demethylation. Our results suggest that XRCC1 is a component of plant BER and functions at several stages during active DNA demethylation. Thus, XRCC1 interacts with ROS1 and ZDP and stimulates their enzymatic activities in vitro. By other hand, cell extracts from xrcc1 mutant plants exhibit a reduced capacity to complete DNA demethylation, and XRCC1 is required for efficient gap-tailoring and DNA ligation. Altogether, the results show that ZDP and XRCC1 function downstream of ROS1 in the active DNA demethylation pathway in plants, and contribute to understand the role of DNA repair mechanisms in the modification of epigenetic patterns.

La metilación del DNA (5-metilcitosina, 5-meC) es una marca epigenética que promueve el silenciamiento génico y desempeña un papel importante en la regulación del desarrollo, la impronta génica, la inactivación del cromosoma X y el silenciamiento de elementos transponibles. Los patrones de metilación se establecen por la acción combinada de mecanismos de metilación y desmetilación. Los mecanismos responsables de la desmetilación activa del DNA en animales no se conocen con exactitud. Sin embargo, en plantas hay convincentes pruebas genéticas y bioquímicas de que proteínas de una subfamilia de DNA glicosilasas, tipificadas por la proteína de ROS1 (REPRESSOR OF SILENCING 1) de Arabidopsis, eliminan la 5-meC del DNA, iniciando su sustitución por una citosina no metilada a través de un proceso análogo a la reparación por escisión de bases (Base Excision Repair, BER). Tras la eliminación de la 5-meC como base libre, ROS1 y sus homólogos rompen el esqueleto azúcar-fosfato del DNA, generado entre otros productos un hueco mono-nucleotídico flanqueado por extremos 3´-P y 5´-P. En esta tesis doctoral se ha demostrado que ZDP, una fosfatasa de DNA, procesa el grupo 3´-P y genera un extremo 3´-OH que puede ser usado por DNA polimerasas para rellenar el hueco y completar la desmetilación. ZDP y ROS1 interaccionan in vitro y co-localizan in vivo en las mismas regiones nucleoplásmicas. También se ha demostrado que plantas mutantes zdp son incapaces de completar la desmetilación in vitro, y que las mutaciones en ZDP causan la hipermetilación y el consiguiente silenciamiento transcripcional de un transgén reportero. Además, un análisis de metilación a escala genómica ha revelado que el DNA de plantas mutantes zdp contiene cientos de regiones que se encuentran hipermetiladas. Por otra parte, los resultados de este trabajo indican que ZDP también desempeña un papel en la reparación de daños en el DNA, probablemente procesando roturas de cadena sencilla generadas directamente por agentes genotóxicos o surgidas indirectamente como intermediarios de reparación. También se ha examinado el posible papel de XRCC1 (X-ray cross complementing group protein 1) en la ruta de desmetilación activa de DNA. Nuestros resultados indican que XRCC1 es un componente del mecanismo de BER en plantas y que participa en varias etapas de la desmetilación. XRCC1 interacciona con ROS1 y ZDP, estimulando las actividades enzimáticas de ambas proteínas in vitro. Los extractos celulares de plantas mutantes xrcc1 muestran una menor capacidad de completar la desmetilación, y XRCC1 facilita tanto la eliminación del grupo 3´-P catalizada por ZDP como el paso final de ligación del DNA. En definitiva, los resultados de esta tesis demuestran que ZDP y XRCC1 funcionan con posterioridad a ROS1 en una ruta de desmetilación activa del DNA en plantas, y contribuyen a entender el papel de la maquinaria de reparación del DNA en la modificación de los patrones epigenéticos.