Identificación de proteínas que participan en una ruta de desmetilación activa de DNA en Arabidopsis thaliana

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Author
Martínez-Macías, M.I.
Director/es
Roldán-Arjona, TeresaRodríguez Ariza, Rafael
Publisher
Universidad de Córdoba, Servicio de PublicacionesDate
2012Subject
GenéticaDNA
ADN
Metilación
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DNA methylation (5-methylcytosine, 5-meC) is an important epigenetic
mark for transcriptional gene silencing that plays critical roles in regulation of
developmental genes, genomic imprinting, X chromosome inactivation and
transposon silencing. Methylation landscapes are established by the combined
actions of methylation and demethylation reactions. The mechanisms
responsible for active DNA demethylation in mammalian cells are still poorly
understood. However, in plants there is convincing genetic and biochemical
evidence that a subfamily of DNA glycosylases typified by Arabidopsis ROS1
(REPRESSOR OF SILENCING 1) remove 5-meC from DNA, initiating its
replacement by unmethylated cytosine through a base excision repair (BER)
process. After 5-meC removal, ROS1 and its homologous cleave the
phophodiester backbone, generating a substantial fraction of products
containing a single-nucleotide gap flanked by 3´- and 5´-phosphate termini. In
this work, it has been found that the DNA phosphatase ZDP removes the
blocking 3´-phosphate, allowing subsequent DNA polymerization and ligation
steps needed to complete demethylation. ZDP and ROS1 interact in vitro and colocalize
in vivo in nucleoplasmic foci. It has also been found that extracts from
zdp mutant plants are unable to complete DNA demethylation in vitro, and
mutations in ZDP cause DNA hypermethylation and transcriptional silencing of a
reporter transgene. Furthermore, genome-wide methylation analysis in zdp
mutant plants identified hundreds of hypermethylated endogenous loci. Our
results also indicate that, besides a role during DNA demethylation, ZDP
participates in the repair of DNA damage, probably by processing single-strand
breaks (SSB) generated either directly by DNA-damaging agents or indirectly as
repair intermediates. This work also examined the possible role of plant XRCC1
(X-ray cross complementing group protein 1) in DNA demethylation. Our results
suggest that XRCC1 is a component of plant BER and functions at several stages
during active DNA demethylation. Thus, XRCC1 interacts with ROS1 and ZDP
and stimulates their enzymatic activities in vitro. By other hand, cell extracts
from xrcc1 mutant plants exhibit a reduced capacity to complete DNA
demethylation, and XRCC1 is required for efficient gap-tailoring and DNA
ligation. Altogether, the results show that ZDP and XRCC1 function downstream
of ROS1 in the active DNA demethylation pathway in plants, and contribute to understand the role of DNA repair mechanisms in the modification of epigenetic
patterns. La metilación del DNA (5-metilcitosina, 5-meC) es una marca epigenética
que promueve el silenciamiento génico y desempeña un papel importante en la
regulación del desarrollo, la impronta génica, la inactivación del cromosoma X y
el silenciamiento de elementos transponibles. Los patrones de metilación se
establecen por la acción combinada de mecanismos de metilación y
desmetilación. Los mecanismos responsables de la desmetilación activa del DNA
en animales no se conocen con exactitud. Sin embargo, en plantas hay
convincentes pruebas genéticas y bioquímicas de que proteínas de una
subfamilia de DNA glicosilasas, tipificadas por la proteína de ROS1 (REPRESSOR
OF SILENCING 1) de Arabidopsis, eliminan la 5-meC del DNA, iniciando su
sustitución por una citosina no metilada a través de un proceso análogo a la
reparación por escisión de bases (Base Excision Repair, BER). Tras la
eliminación de la 5-meC como base libre, ROS1 y sus homólogos rompen el
esqueleto azúcar-fosfato del DNA, generado entre otros productos un hueco
mono-nucleotídico flanqueado por extremos 3´-P y 5´-P. En esta tesis doctoral
se ha demostrado que ZDP, una fosfatasa de DNA, procesa el grupo 3´-P y
genera un extremo 3´-OH que puede ser usado por DNA polimerasas para
rellenar el hueco y completar la desmetilación. ZDP y ROS1 interaccionan in
vitro y co-localizan in vivo en las mismas regiones nucleoplásmicas. También se
ha demostrado que plantas mutantes zdp son incapaces de completar la
desmetilación in vitro, y que las mutaciones en ZDP causan la hipermetilación y
el consiguiente silenciamiento transcripcional de un transgén reportero. Además,
un análisis de metilación a escala genómica ha revelado que el DNA de plantas
mutantes zdp contiene cientos de regiones que se encuentran hipermetiladas.
Por otra parte, los resultados de este trabajo indican que ZDP también
desempeña un papel en la reparación de daños en el DNA, probablemente
procesando roturas de cadena sencilla generadas directamente por agentes
genotóxicos o surgidas indirectamente como intermediarios de reparación.
También se ha examinado el posible papel de XRCC1 (X-ray cross
complementing group protein 1) en la ruta de desmetilación activa de DNA.
Nuestros resultados indican que XRCC1 es un componente del mecanismo de
BER en plantas y que participa en varias etapas de la desmetilación. XRCC1
interacciona con ROS1 y ZDP, estimulando las actividades enzimáticas de ambas
proteínas in vitro. Los extractos celulares de plantas mutantes xrcc1 muestran una menor capacidad de completar la desmetilación, y XRCC1 facilita tanto la
eliminación del grupo 3´-P catalizada por ZDP como el paso final de ligación del
DNA. En definitiva, los resultados de esta tesis demuestran que ZDP y XRCC1
funcionan con posterioridad a ROS1 en una ruta de desmetilación activa del DNA
en plantas, y contribuyen a entender el papel de la maquinaria de reparación del
DNA en la modificación de los patrones epigenéticos.