Evaluación de la bacteria transformada Paenibacillus polymixa, que expresa la toxina Cry1C de Bacillus thuringiensis, como insecticida y biofertilizante en algodón

Abstract

Spodoptera littoralis (Boisudval) es un lepidóptero de la familia Noctuidae cuyas larvas se desarrollan a expensas de numerosas plantas, causando daños importantes en cultivos del área mediterránea como algodón, alfalfa y hortícolas, entre otros. Con objeto de desarrollar nuevas materias activas que puedan sustituir a los actuales insecticidas químicos de síntesis, la bacteria esporígena Bacillus thuringiensis constituye un recurso natural que se comercializa como insecticida biológico, utilizando como ingrediente activo la toxicidad selectiva por ingestión de δ-endotoxinas constituyentes del cristal parasporal, conocidas como proteínas Cry. Para mejorar la limitada persistencia y estabilidad en campo de los preparados comerciales de B. thuringiensis se han desarrollado técnicas que permiten la inserción de los genes cry (que expresan proteínas Cry específicas) en organismos con capacidad de colonizar la planta huésped del fitófago. En este estudio se ha evaluado el potencial insecticida de una bacteria fijadora de Nitrógeno, Paenibacillus polymyxa, que incorpora el gen de cry1C (que expresa Cry1C, una de las proteínas de B. thuringiensis más tóxicas para S. littoralis). En primer lugar, mediante bioensayos de actividad biológica en laboratorio, se ha determinado la toxicidad de la bacteria P. polymyxa transformada y se ha visto que es comparable a la de B. thuringiensis var. aizawai, que contiene de forma natural el gen cry1C. Se han estudiado los posibles efectos en el desarrollo y reproducción de S. litttoralis en los supervivientes a la ingestión de dosis subletales. Las larvas tratadas con P. polymyxa transformada y con B. thuringiensis var. aizawai muestran un notable incremento en el tiempo de desarrollo larvario, disminución del peso de las pupas y reducción del porcentaje de viabilidad de huevos. También se ha evaluado otras propiedades que repercuten en la eficacia insecticida, como el tiempo de persistencia en la planta después de su aplicación y la supervivencia de la bacteria en el tejido vegetal. Ensayos con plantas de algodón bajo condiciones de campo, se ha comprobado que la bacteria transformada P. polymyxa mantiene la actividad insecticida al menos durante 30 días después de la pulverización foliar de suspensiones de cristales y esporas. Esta alta persistencia de toxicidad se confirma también en condiciones de umbráculo y de invernadero, en donde no difiere dela persistencia de B. thuringiensis var. aizawai. La presencia de la toxina Cry1C en el interior de los tejidos se ha confirmado por SDS-PAGE y la presencia de la bacteria mediante la detección del gen cry1C por PCR. Se ha evaluado también la capacidad de desarrollo de resistencia de las poblaciones de S. littoralis, durante 12 generaciones de selección para resistencia a P. polymyxa transformada, en comparación con una población seleccionada para resistencia a B. thuringiensis var. aizawai y una tercera no seleccionada. La población seleccionada para resistencia a B. thuringiensis var. aizawai no mostró cambios en susceptibilidad a la acción letal de la bacteria, aunque ensayos de desarrollo y reproducción detectaron reducción del periodo de desarrollo y disminución en la viabilidad de huevos. Por otro lado, durante 12 generaciones de selección para resistencia a P. polymyxa transformada se observó una progresiva reducción de la susceptibilidad larvaria hasta alcanzar en un factor de resistencia de 5,47 respecto de la población no seleccionada. La población tolerante se caracterizó biológicamente por un mayor peso de las pupas, aumento de la fecundidad de hembras y menor porcentaje de viabilidad de huevos. Por último, se han realizado ensayos con plantas de algodón para conocer si la transformación de la bacteria mediante la incorporación del gen cry1C no afecta a las características de esta bacteria como fijadora de Nitrógeno y biofertilizante. La aplicación en suelo de P. polymyxa transformada produjo un aumento de la actividad nitrogenasa así como un mayor contenido de Nitrógeno en las plantas inoculadas, incluso en mayor medida que P. polymyxa no transformada. Los niveles de clorofila y carotenoides aumentaron progresivamente durante cuatro semanas después de la inoculación con P. polymyxa transformada, de forma similar al efecto de P. polymyxa no transformada.

Spodoptera littoralis (Boisudval) is a lepidopterous belonging to the family Noctuidae whose larvae feed on many plants, causing significant damage to crops in the Mediterranean area as cotton, alfalfa and vegetables, among others. In order to develop new active ingredients that can replace existing synthetic chemical insecticide, the Bacillus thuringiensis sporigenic bacteria is a natural resource that is marketed as biological insecticide, using as active ingredient the selective toxicity by ingestion of δ- endotoxins, known as Cry proteins, which forms the parasporal crystals. In order to improve the limited persistence and stability in the field of B. thuringiensis commercial preparations, techniques that allow the insertion of the cry genes (which express specific Cry proteins) in organisms capable of colonizing the phytophagous host plant have been developed. In this study we have evaluated the potential insecticide from a nitrogen-fixing bacterium, Paenibacillus polymyxa, which incorporates the cry1C gene (expressing Cry1C, one from the more toxic B. thuringiensis proteins agianst S. littoralis). First, by bioassays of biological activity in laboratory, we have determined that the toxicity of the transformed P. polymyxa is comparable with the B. thuringiensis var. aizawai which naturally contains the gene cry1C. We have studied the possible effects on S. litttoralis development and reproduction in survivors of sublethal doses. Larvae treated with transformed P. polymyxa and with B. thuringiensis var. aizawai show a marked increase in larval development time, reduced pupal weight and reduction in egg-viability. We also evaluated other properties affecting the insecticidal efficacy, such as persistence time after application and the survival of bacteria in vegetal tissues. By assays with cotton plants under field conditions, it was found that insecticidal activity of transformed P. polymyxa remains at least 30 days after foliar spray of crystals and spores suspensions. This high persistence of toxicity is also confirmed in semi-field and greenhouse conditions, where no different from the persistence of B. thuringiensis var. aizawai. The presence of the toxin Cry1C within tissues has been confirmed by SDSPAGE and the presence of bacteria by detecting cry1C gene by PCR. It has also assessed the ability of developing resistance populations of S. littoralis for 12 generations of selection for resistance to transformed P. polymyxa compared with the population selected to B. thuringiensis var. aizawai and untreated population. The population selected for resistance to B. thuringiensis var. aizawai showed that there are no changes in susceptibility to the bacteria, although the bioassays of growth and reproduction indicated reduction of development period and decreased egg-viability. On the other hand, during 12 generations of selection for resistance to transformed P. polymyxa showed a progressive reduction of larval susceptibility to reach a 5.47 resistance factor with respect to untreated population. The tolerant population was characterized biologically by increased pupal weight, increased female fecundity and lower percentage of viable eggs. Finally, studies have been conducted with cotton plants to determine if the transformation of the bacteria (incorporating the cry1C gene) not affected on the characteristics of this bacterium as nitrogen-fixing and biofertilizer. The soil treated with the transformed P. polymyxa resulted in increased either in nitrogenase activity and in nitrogen content in treated plants, more than untransformed P. polymyxa. The levels of chlorophyll and carotenoid progressively increased until four weeks after treated with transformed P. polymyxa, similarly to the effect of untransformed P. polymyxa.