Targeting metabolism to improve immunotherapy in gsnor-deficient colorectal cancer

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is the third most diagnosed type of cancer and the second leading cause of cancer death worldwide. Despite the increasing knowledge of CRC molecular biology and the development of new targeted therapies, its high heterogeneity hampers the efficacy of current treatments. Thus, there is a pressing need to identify new effective therapeutic targets and improve immune therapies for these patients. In this regard, S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR) is a denitrosylase enzyme that has been suggested to play a tumour suppressor role, although the mechanisms responsible are still largely unclear. Therefore, the main objective of this thesis project was to understand the role of GSNOR in CRC tumorigenesis and its therapeutic implications. Firstly, we classified CRC tumours as GSNOR-high or low according to their GSNOR expression as assessed by immunohistochemistry (IHC). Interestingly, healthy colon tissue exhibited a higher level of GSNOR expression compared to tumour tissue. This suggests a progressive loss of expression of this denitrosylase enzyme during tumorigenesis. Accordingly, we found that GSNOR deficiency was associated with worse prognosis factors such as a larger tumour size at diagnosis, higher TNM stage, higher grade of tumour budding (TB), the CMS4 subtype, lower expression of the intestinal differentiation markers CDX2 and AE1/AE3 cytokeratin and a worse progression free survival (PFS) and overall survival (OS). We next investigated the differences in gene expression between CRC GSNOR-high and low tumours, uncovering significant alterations in metabolism and immune system pathways. Hence, GSNOR-deficient tumours were characterized by immune suppressive features and a dysregulation of their metabolism, favouring other metabolic pathways than OXPHOS. These differences were further confirmed with a proteomic analysis that revealed that GSNOR-low tumours were enriched in proteins involved in tumour immune evasion, alongside decreased levels of proteins related to mitochondrial metabolism. The immune suppressive profile of GSNOR-low tumours was corroborated with the marked exclusion of CD8+ T cells in tumour stroma. Next, we employed CRISPR-Cas9–mediated GSNOR gene knockout (KO) CRC cells along with patient-derived organoids (PDOs) and xenografts (PDXs) to deepen into the role of GSNOR in CRC metabolism and immune tumour microenvironment. We observed that GSNOR-KO cells exhibited smaller and lighter mitochondria with unidentifiable cristae morphology. Attending to their metabolism, GSNOR-KO cells exhibited lower OXPHOS rates but retained a significant respiratory reserve capacity, suggesting they have an increased metabolic plasticity. Besides, GSNOR-KO cells posed a lower glycolytic reserve capacity, indicating that they are operating close to their maximal glycolytic rate. Accordingly, we confirmed that both PDOs and PDXs from GSNOR-low tumours exhibited increased sensitivity to glycolysis inhibition with 2-Deoxy-Glucose (2DG). Taken together, our data suggest that GSNOR deficiency impairs metabolism in CRC, rewiring cell metabolism towards glycolysis as the main source of energy. Regarding the immune system, we observed that GSNOR-KO cells displayed elevated levels of the immune checkpoint PD-L1 and enhanced resistance to T cell mediated cytotoxicity. Notably, PD-1 blockade did not promote lymphocytes cytotoxicity against GSNOR-KO cells, unless NO synthesis was inhibited. This strongly supports the connection between GSNOR deficiency, altered S-nitrosthiol homeostasis, and the acquisition of immune evasive phenotypes in CRC. Accordingly, our in vivo assay using humanized xenografts revealed that PD-1 blockade did not enhance T cell cytotoxicity against GSNOR-KO cells because the loss of GSNOR prevented T cell infiltration into the tumour and hampered T cell activation. On the contrary, PD-1 blockade enhanced T cell recruitment into GSNOR-WT tumours and favoured an active immune phenotype of CD4+ T cells, DN T cells and γδ T cells, which exerted cytotoxicity against the tumours. Based on the above results we next hypothesized whether targeting the metabolic vulnerabilities associated with GSNOR deficiency could potentially restore T cell cytotoxicity against these tumours. By using GSNOR-WT/GSNOR KO cells, PDOs and humanized xenografts we validated that GSNOR-deficient tumours were sensitive to 2DG alone and only responded to PD-1 blockade treatment when combined with 2DG, with higher immune cell-mediated cytotoxicity than either treatment alone. Thus, targeting metabolism could be a potent therapy not only to restore sensitivity to PD-1 blockade but also to enhance the antitumor immune response in GSNOR-low CRC with a worse prognosis. Our study demonstrates that GSNOR-deficiency promotes a metabolic shift in tumour cells that underlies tumour progression and immune evasion in CRC. Thus, enhanced glycolytic metabolism in GSNOR-deficient cells fosters an immunosuppressive TME by excluding cytotoxic immune cells and recruiting immune suppressive cells. Moreover, we have validated glycolysis as a metabolic vulnerability that can be targeted in combination with anti-PD1 therapy to boost immunotherapy in GSNORdeficient CRC tumours. Our discoveries enhance our understanding of the proposed tumour-suppressive role for GSNOR, offering insights that may elucidate the complex role nitric oxide-mediated signalling in cancer.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de tumor más diagnosticado y la segunda causa de muerte por cáncer a nivel mundial. A pesar de conocer cada vez mejor su biología molecular y del desarrollo de nuevas terapias dirigidas, su gran heterogeneidad limita la eficacia de los tratamientos actuales. Por ello, es necesario identificar nuevas dianas terapéuticas efectivas y mejorar la inmunoterapia para estos pacientes. En este sentido, la S-nitrosoglutatión reductasa (GSNOR) es una enzima denitrosilasa que parece actuar como supresor tumoral, aunque los mecanismos responsables aún no están claros. Por tanto, el objetivo principal de esta tesis fue comprender el papel de GSNOR en la tumorigénesis del CCR y las posibles implicaciones terapéuticas. Para ello, en primer lugar, clasificamos tumores de CCR en GSNOR-alta o baja atendiendo a la expresión de GSNOR determinada por inmunohistoquímica (IHQ). Destacablemente, el tejido de colon sano mostró un mayor nivel de expresión de GSNOR comparado con el tejido tumoral. Esto sugiere una disminución progresiva de la expresión de esta enzima denitrosilasa durante la tumorigénesis. En consecuencia, cuando estudiamos las características clínico-patológicas de tumores de CCR, encontramos que la deficiencia de GSNOR se asociaba a factores de peor pronóstico, como un mayor tamaño tumoral al diagnóstico, un estadio TNM más avanzado, mayor grado de budding tumoral (BT), el subtipo de peor pronóstico CMS4, una menor expresión de marcadores de diferenciación intestinal como CDX2 y citokeratinas AE1/AE3, así como peores supervivencias libre de progresión (SLP) y global (SG). A continuación, cuando se investigaron las diferencias en la expresión génica entre tumores de CCR con GSNOR-alta y baja, se encontraron alteraciones significativas en el metabolismo y el sistema inmune. Así, los tumores con baja expresión de GSNOR se caracterizaron por características inmunoevasivas y una desregulación del metabolismo que favorecía otras vías metabólicas distintas a la fosforilación oxidativa. Estas diferencias se confirmaron además con un análisis proteómico que reveló que los tumores con baja expresión de GSNOR estaban enriquecidos en proteínas involucradas en la evasión inmune, junto con niveles reducidos de proteínas relacionadas con el metabolismo mitocondrial. El perfil inmunosupresor de los tumores con baja expresión de GSNOR se corroboró con el hallazgo de una marcada exclusión de linfocitos T citotóxicos CD8+ en su estroma tumoral. A continuación, y para profundizar en el papel de GSNOR en el metabolismo y microambiente inmune tumoral del CCR, se utilizaron células totalmente deficientes en GSNOR (GSNOR-KO) mediante ablación génica usando CRISPR-Cas9, junto con organoides y xenoinjertos derivados de pacientes (PDOs y PDXs). Observamos que las mitocondrias de las células GSNOR-KO eran más pequeñas y de menos densidad, con un morfología de crestas no identificable. En cuanto a su metabolismo, las células GSNOR-KO mostraron tasas de fosforilación oxidativa más bajas, pero mantuvieron una capacidad respiratoria de reserva significativa, lo que sugiere una mayor plasticidad metabólica. Además, las células GSNOR-KO mostraron una menor capacidad de reserva glicolítica, lo que indica que funcionan cerca de su tasa máxima de glicólisis. De hecho, confirmamos que tanto PDOs como PDXs de tumores con baja expresión de GSNOR eran más sensibles a la inhibición de la glucólisis con 2-desoxiglucosa (2DG). En conjunto, nuestros datos sugieren que la deficiencia de GSNOR altera el metabolismo en CCR, reprogramando el metabolismo celular hacia la glucólisis como principal fuente de energía. En cuanto al sistema inmune, observamos que las células GSNOR-KO expresaban niveles elevados de expresión del punto de control inmune PD-L1 y mostraron una mayor resistencia a la citotoxicidad mediada por linfocitos T. Destacablemente, el bloqueo de PD-1 no mejoró la actividad citotóxica de los linfocitos contra las células GSNOR-KO, a menos que se inhibiese la síntesis de NO. Esto confirma la conexión entre la deficiencia de GSNOR, la alteración en la homeostasis de S-nitrosotioles y la adquisición de un fenotipo inmunoevasivo en CCR. De esta manera, nuestro ensayo in vivo utilizando xenoinjertos humanizados mostró que el bloqueo de PD-1 no mejoraba la citotoxicidad de los linfocitos T contra las células GSNOR-KO porque la deficiencia en GSNOR impide la infiltración de los linfocitos T en el tumor y dificulta su activación. Por el contrario, el bloqueo de PD-1 mejoró el reclutamiento de linfocitos T en los tumores GSNOR-WT y favoreció un fenotipo inmune activo de células T CD4+, DN y γδ, que ejercieron una función citotóxica contra los tumores. Basándonos en los resultados anteriores, planteamos la hipótesis de si las vulnerabilidades metabólicas asociadas a la pérdida de GSNOR podrían representar una diana terapéutica para restaurar la actividad citotóxica de los linfocitos T contra estos tumores. Así, mediante el uso de las células GSNOR-WT y KO, PDOs y PDXs humanizados, validamos que los tumores deficientes en GSNOR son sensibles al tratamiento con 2DG y que únicamente responden al bloqueo de PD-1 cuando se combina con 2DG, lo que favorece una citotoxicidad inmune mayor que con cualquiera de los tratamientos por separado. Por tanto, el metabolismo podría ser una diana terapéutica eficaz no sólo para restaurar la sensibilidad al bloqueo de PD-1, sino también para mejorar la respuesta inmune antitumoral en los tumores de CCR con baja expresión de GSNOR y un peor pronóstico. En resumen, nuestro estudio demuestra que la deficiencia en GSNOR promueve cambios metabólicos en las células tumorales, que subyacen a la progresión tumoral y a la inmunoevasión en CCR. De esta manera, una mayor actividad glucolítica en las células deficientes en GSNOR fomenta un microambiente tumoral inmunosupresor al excluir células inmunes citotóxicas y reclutar en cambio células inmunes inmunosupresoras. Además, hemos validado la glucólisis como vulnerabilidad metabólica que puede usarse en combinación con terapia anti-PD-1 para mejorar la inmunoterapia en tumores de CCR deficientes en GSNOR. Finalmente, nuestros resultados ayudan a comprender mejor el papel supresor tumoral de GSNOR, proporcionando información sobre la compleja señalización mediada por óxido nítrico en cáncer.