Análisis molecular y funcional de la proteína MBD4 de Arabidopsis thaliana

Abstract

MBD4 es una ADN glicosilasa que ha sido propuesta como un factor central para el mantenimiento de la integridad del genoma y las respuestas al daño del ADN en animales. Existen pruebas de que en vertebrados participa en la reparación por escisión de bases, la reparación de apareamientos erróneos, el control del ciclo celular en respuesta a daños en el genoma y la desmetilación del ADN. Sin embargo, se desconoce si en plantas existe alguna proteína que desempeñe funciones similares. En esta Tesis se ha identificado un gen de la planta modelo Arabidopsis thaliana que codifica un posible ortólogo de MBD4. El objetivo principal del trabajo ha sido determinar si la proteína MBD4 de A. thaliana está implicada en el mantenimiento de la estabilidad del genoma de la planta. Para la caracterización in vitro de la actividad bioquímica de MBD4 se ha purificado la enzima en forma recombinante y se ha analizado su actividad catalítica sobre diferentes lesiones localizadas en diversos contextos de secuencia. Los resultados indican que posee actividad ADN glicosilasa frente a uracilo (U) y timina (T) apareados erróneamente con guanina (G), lo que sugiere que previene la mutagénesis causada por la desaminación espontánea de C y 5-meC a U y T, respectivamente. Además, los resultados indican que MBD4 se une al sitio abásico que genera en el ADN tras la escisión de la base, lo que explicaría su baja tasa de recambio in vitro. Paralelamente a su caracterización bioquímica, se ha estudiado la función in vivo de esta enzima. Mediante PCR en tiempo real y transformación de plantas con una construcción del gen GUS precedido del promotor de MBD4 se han analizado los niveles de expresión en diferentes tejidos y etapas del desarrollo de Arabidopsis. Se ha observado que MBD4 se expresa en múltiples tejidos y a lo largo de todo el desarrollo de la planta, lo que concuerda con una función de mantenimiento del ADN en condiciones normales de crecimiento. Se ha identificado una línea de plantas mutantes (FLAG_249E06) que presentan una inserción de ADN-T en la región 3’ UTR de MBD4, y se ha comprobado que las plantas homocigotas para para la inserción (mbd4-/-) tienen un nivel de expresión de MBD4 muy reducido. Además, se ha llevado a cabo un análisis fenotípico de las plantas mutantes en comparación con las silvestres y se ha estudiado su respuesta a la presencia de diferentes mutágenos. Las plantas mbd4-/- muestran un fenotipo aparentemente normal en condiciones estándar de crecimiento, a excepción de un tamaño reducido de la roseta basal y una menor longitud de la raíz. Sin embargo, son más resistentes que las silvestres a los efectos genotóxicos de MMS y 5-FU, y dicha resistencia aumenta si la deficiencia en MBD4 se combina con una deficiencia en la uracil ADN glicosilasas UNG. Por otra parte, las plantas mutantes mbd4-/- presentan una expresión constitutiva de la ciclina CYCB1;1, lo que sugiere una activación continua de la respuesta a estrés genotóxico en ausencia de MBD4. 3...