Análisis orientado y global en metabolómica vegetal mediante espectrometría de masas acoplada a técnicas cromatográficas

Abstract

1. Introducción o motivación de la tesis. La investigación desarrollada en esta Tesis Doctoral se centró en el estudio de tres matrices vegetales diferentes usando la espectrometría de masas acoplada a técnicas cromatográficas. En primer lugar, se estudió la piel de la naranja, un residuo mayoritario de la industria de zumos, con el objetivo de evaluar su contenido en compuestos de interés, así como de desarrollar un método de extracción asistido por ultrasonidos. Objetivo de esta parte fue también determinar el contenido en flavonoides de la piel de distintas variedades de naranja y evaluar el efecto del método de secado de esta materia prima en la concentración de estos compuestos. La segunda matriz vegetal estudiada en esta Tesis Doctoral fue la estevia rebaudiana, una planta que ha ganado una gran popularidad por su poder edulcorante y cuyo cultivo se está introduciendo actualmente en España. La investigación desarrollada tuvo como objetivo identificar los distintos compuestos que están presentes en sus hojas y cuantificar los principales de ellos (glicósidos de esteviol y compuestos fenólicos) en diferentes variedades y en diferentes tipos de cultivo de esta planta. Por último, se llevaron a cabo estudios sobre el ajo y el ajo negro (ajo fermentado). El ajo fresco había sido parcialmente estudiado antes de la investigación recogida en esta Tesis, mientras que poco se sabía sobre la composición del ajo negro. El objetivo de esta investigación fue determinar la composición de la fracción volátil y polar de tres variedades diferentes de ajo fresco y de ajo negro, así como establecer las diferencias composicionales entre ajo fresco y negro y evaluar la evolución de ambas fracciones a lo largo de la fermentación. 2. Contenido de la investigación. El contenido de la investigación realizada ha implicado: - Conocer las técnicas más empleadas en el estudio de material agroalimentario: las principales técnicas de extracción, tanto convencionales, como las asistidas por energías auxiliares; así como las técnicas de análisis más empleadas, desde metodologías establecidas para el análisis de una propiedad dada hasta técnicas más complejas que aportan una mayor información, como es la espectrometría de masas. - Desarrollar una metodología basada en el uso de ultrasonidos para la obtención de compuestos de interés a partir de la piel de naranja. Esta metodología permitió obtener conjuntamente los extractos polar y apolar, cuyo análisis mediante LC−QTOF MS/MS permitió identificar en ellos un gran número de flavonoides y cumarinas. - Establecer un método basado en LC−QqQ para la cuantificación de los flavonoides mayoritarios en la piel de distintas variedades de naranja. Este método de análisis también se empleó para evaluar el efecto de la liofilización y del secado en estufa en la concentración de estos compuestos en la piel de naranja en comparación con la materia fresca. - Identificar los compuestos presentes en las hojas de estevia rebaudiana analizando los extractos polar y apolar mediante LC−QTOF MS/MS. De esta forma se identificaron las principales familias que conforman el perfil composicional de las hojas de esta planta, en la que destacaron los glicósidos de esteviol y los compuestos fenólicos. - Cuantificar los glicósidos de esteviol y compuestos fenólicos más importantes en las hojas de la estevia rebaudiana usando diferentes metodologías basadas en LC−QqQ. De esta forma se cuantificaron estos compuestos en las hojas de diferentes variedades de esta planta. - Caracterizar el perfil volátil y polar de tres variedades de ajo fresco, así como de ajo negro identificando los aminoácidos y derivados, los compuestos organosulfurados y los volátiles aromáticos como compuestos más característicos del ajo. - Comparar la composición del ajo fresco y el negro y estudiar la evolución de la composición a lo largo de la fermentación, estableciendo que los aminoácidos y derivados y compuestos organosulfurados son los más afectados por este proceso. - Estudiar el efecto del calentamiento en el perfil volátil de las tres variedades de ajo fresco y ajo negro, estableciendo los cambios que se producen en su aroma al ser cocinados. 3.Conclusión. El estudio de la piel de la naranja ha permitido concluir que: - El uso de ultrasonidos para favorecer la formación de emulsiones de extractantes inmiscibles supone una importante ventaja a la hora de extraer de forma simultánea y rápida los compuestos de interés (polares y apolares) presentes en la piel de la naranja. - La identificación tentativa de los compuestos extraídos ha permitido identificar una gran variedad de compuestos en la piel de naranja, entre los que cabe destacar flavonoides como la neohesperidina, naringina y tangeretina, y las cumarinas. - El estudio de la piel de diferentes variedades de naranja permitió establecer diferencias significativas en su concentración de flavonoides, correspondiendo el perfil más diferenciado a la naranja amarga. - La comparación de dos técnicas de secado, liofilización y secado en estufa, puso de manifiesto que este pretratamiento afecta a los compuestos de la piel de naranja, especialmente el secado en estufa ya que el calor favorece la degradación de los flavonoides glicosilados, por lo que aumenta la concentración de las formas aglicona. Del estudio de la estevia rebaudiana recogido en esta Tesis Doctoral se concluye que: - La identificación de un total de 89 compuestos polares y apolares en las hojas de estevia rebaudiana ha puesto de manifiesto la variedad en la composición de esta planta, no solo en edulcorantes sino también en otros compuestos de interés. - Las familias más importantes identificadas en la estevia rebaudiana fueron los glicósidos de esteviol, ampliamente conocidos por su poder edulcorante, y los ácidos quínico, cafeico y derivados, donde cabe destacar los ácidos cafeoilquínicos, compuestos con una gran capacidad antioxidante. - El estudio de la concentración de glicósidos de esteviol en las hojas de esta planta mostró que el esteviósido y el rebaudiósido A son los compuestos mayoritarios, independientemente de la variedad o del tipo de cultivo. - El tipo de cultivo de la estevia rebaudiana influye drásticamente en la concentración de glicósidos de esteviol en las hojas, obteniendo una mayor concentración en la cultivada en el campo. - Las ramas de la planta tienen, en general, una menor concentración de glicósidos de esteviol que las hojas. - Los compuestos fenólicos, especialmente los ácidos cafeoilquínicos y los flavonoides derivados de la quercetina, están presentes en una alta concentración (del orden de los mg/g de hoja seca) en las hojas de estevia rebaudiana. - La variedad EiretexMorita es la que contiene una mayor concentración en ácidos cafeoilquínicos y un perfil fenólico más diferente al resto de variedades, mientras la variedad Eirete tiene una mayor concentración en flavonoides. De la investigación recogida en esta Memoria sobre el ajo fresco y negro se desprenden las siguientes conclusiones: - La identificación de compuestos en ajo fresco dio como resultado 45 compuestos volátiles —entre los que destacan los compuestos organosulfurados y aromáticos— y de 82 compuestos polares, muchos de ellos aminoácidos y derivados, pero también compuestos organosulfurados. - La concentración de los diferentes compuestos identificados, especialmente los aminoácidos y compuestos oragnosulfurados tanto volátiles como polares, permite diferenciar las tres variedades de ajo estudiadas. - Los 51 compuestos volátiles y 93 polares identificados en ajo negro muestran que algunos son exclusivos de este producto de la fermentación (como los que le confieren los aromas dulce y tostado), lo que pone de manifiesto los cambios producidos durante la fermentación. - La fermentación disminuye progresivamente la concentración de compuestos organosulfurados tanto volátiles como polares, afectando claramente a la ruta de síntesis de estos compuestos. - La concentración de aminoácidos y derivados cambia de forma notable durante la fermentación, indicando que este proceso tiene un fuerte impacto en estos compuestos. - El comportamiento del furfural y derivados y de los azúcares y derivados muestra que la fermentación produce la activación de la reacción de Maillard a lo largo del proceso. - El estudio de las tres variedades de ajo fresco y de ajo negro cuando se someten a calentamiento permite extrapolar los cambios que se producen en la fracción volátil a los que experimentarán durante el cocinado.