Role of nitric oxide in the biology of intestinal cancer stem cells: new options in the treatment of colorectal cancer

Abstract

Nitric oxide (NO) has been highlighted as an important agent in cancer-related events. Although the inducible nitric oxide synthase (iNOS) isoform has received most of the attention, recent literature indicates that the endothelial isoenzyme (eNOS) can also modulate different tumor processes including resistance, angiogenesis, invasion, and metastasis. However, the role of eNOS in cancer stem cell (CSC) biology and colorectal cancer (CRC) is unknown. Here, we show that eNOS was significantly upregulated in intestinal tissue of VilCreERT2Apcfl/+ and VilCreERT2Apcfl/fl mice, which are models of intestinal cancer initiation, with an intense immunostaining in hyperproliferative crypts. Similarly, the more invasive VilCreERT2Apcfl/+ Ptenfl/+ mouse model showed an overexpression of eNOS in intestinal tumors whereas this isoform was not expressed in normal tissue. However, none of the three models showed substantial iNOS expression. Notably, when 40 human colorectal tumors were classified into different clinically relevant molecular subtypes, high eNOS expression was found in the poor relapse-free and overall survival mesenchymal subtype. Similarly, eNOS was found highly expressed in non-classified poorly differentiated human colorectal tumors. Accordingly, CRC patients with high eNOS and low iNOS expression showed a significantly lower 5-year survival rate. Furthermore, Apcfl/fl organoids overexpressed eNOS compared with wt organoids and NO depletion with the scavenger c-PTIO decreased the proliferation and the expression of stem cell markers, such as Lgr5, Troy, Vav3 and Slc14a1, in these intestinal organoids. Besides, specific NO depletion also decreased the expression of CSC-related proteins in human CRC cells such as β–catenin and Bmi1, impairing the CSC phenotype. To rule out the contribution of iNOS in this effect, we stablished an iNOS-knockdown CRC cell line and we found that NO scavenging in this iNOS-deficient scenario also impaired the expression of CSC-related proteins. To further explore the antitumor capacity of NO scavenging-based therapies we performed several in vivo assays. NO-depleted CRC cells showed a decreased capacity to form tumors in mice and c-PTIO treatment in vivo showed an antitumor effect in a CRC cell-line derived xenograft mouse model. The anticancer effect of c-PTIO was also confirmed in patient derived xenografts (PDXs), where tumor volume was notably reduced. On the other hand, we found that NO scavenging sensitized both chemo-naive and chemoresistant CRC cells to chemotherapy and avoided the CSC-enrichment after the treatment. Depletion of NO also resulted in a massive arrest in G2 phase of cell cycle and downregulation of cyclin D1 in CRC cells. Interestingly, the treatment with chemotherapeutic agents in vivo resulted in a high upregulation of eNOS isoenzyme, suggesting a potential adaptive mechanism of chemoresistance. Overall, our data support that eNOS upregulation occurs after Apc loss, emerging as an unexpected potential new target in poor-prognosis mesenchymal colorectal tumors, where NO scavenging could represent an interesting therapeutic alternative to target the CSC subpopulation. Besides, the upregulation of eNOS after chemotherapy treatment suggests that efficiently targeting NO may sensitize both chemo-naive and chemoresistant CRC cells to these agents in vivo.

El óxido nítrico (NO) se ha identificado como una importante molécula en procesos relacionados con el cáncer. Aunque la isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa (iNOS) ha sido la más estudiada, trabajos más recientes indican que la isoenzima endotelial (eNOS) puede también modular diferentes procesos tumorales tales como resistencia, angiogénesis, invasión y metástasis. Sin embargo, se desconoce el papel de la eNOS en la biología de las células madre tumorales (CSCs) intestinales y en cáncer colorrectal (CCR). En el presente estudio la expresión de eNOS se encontró significativamente elevada en tejido intestinal de ratones VilCreERT2Apcfl/+ y VilCreERT2Apcfl/fl, que son modelos de iniciación de cáncer intestinal, con una intensa tinción en las criptas hiperproliferativas. De manera similar, el modelo de ratón VilCreERT2Apcfl/+ Ptenfl/+, que presenta un fenotipo más invasivo, mostró una alta expresión de eNOS en tumores intestinales, mientras que esta isoforma no se expresaba en tejido normal. Sin embargo, ninguno de estos tres modelos mostró una expresión apreciable de iNOS. De manera destacable, cuando se clasificaron 40 tumores colorectales humanos en diferentes subtipos moleculares clínicamente relevantes, se encontró una alta expresión de eNOS en el subtipo mesenquimal, con bajas tasas de supervivencia global y libre de recidiva. De manera similar, la eNOS se encontró altamente expresada en tumores colorectales humanos no clasificados y pobremente diferenciados. Consecuentemente, aquellos pacientes de CCR con una alta expresión de eNOS y una baja expresión de iNOS mostraron una tasa de supervivencia a 5 años significativamente más baja. Además, los organoides obtenidos a partir de tejido intestinal de ratones Apcfl/fl mostraron una alta expresión de eNOS en comparación con organoides silvestres y la eliminación específica de NO con el compuesto c-PTIO disminuyó la proliferación y la expresión de marcadores de CSCs, tales como Lgr5, Troy, Vav3 y Slc14a1, en estos organoides intestinales. La eliminación específica de NO también disminuyó la expresión de proteínas relacionadas con CSCs en células de CCR humano tales como β–catenina y Bmi1, deteriorando el fenotipo CSC. Para descartar la contribución de iNOS en este efecto, se estableció una línea celular de CCR donde se silenció la expresión de iNOS y en la que la retirada de NO también impactó negativamente en la expresión de proteínas relacionadas con las CSCs. Para explorar la capacidad antitumoral de terapias basadas en la retirada de NO, se realizaron varios experimentos in vivo. Así, células de CCR a las que previamente se les retiró el NO mostraron una menor capacidad para formar tumores en ratones y además el tratamiento con c-PTIO in vivo mostró un claro efecto antitumoral en un modelo murino de xenoinjerto de línea celular. Este efecto también se encontró en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes (PDXs), donde el volumen tumoral se redujo notablemente. Por otro lado, la eliminación específica de NO sensibilizó tanto a células de CCR inicialmente respondedoras como a quimiorresistentes a quimioterapia, y evitó el enriquecimiento de CSCs tras el tratamiento. La retirada de NO también resultó en una detención masiva en la fase G2 del ciclo celular y una disminución en la de expresión de la ciclina D1 en células de CCR. Inesperadamente, el tratamiento con agentes quimioterápicos in vivo resultó en un acusado aumento de la expresión de eNOS, lo que sugiere un potencial mecanismo adaptativo de quimiorresistencia. En conjunto, los datos del presente estudio apoyan que el aumento de expresión de eNOS ocurre tras la pérdida de Apc, emergiendo como una potencial e inesperada nueva diana en tumores colorrectales mesenquimales de peor prognosis, donde la retirada de NO podría representar una interesante alternativa terapéutica para eliminar la subpoblación de CSCs. Además, el aumento de expresión de eNOS tras el tratamiento con quimioterapia sugiere que la eliminación eficiente de NO podría sensibilizar tanto a células tumorales inicialmente respondedoras como a quimiorresistentes a estos agentes in vivo.