Aportaciones al conocimiento reproductivo en el caballo Pura Raza Español: fertilidad, vitrificación de esperma y monitorización de la gestación
Contributions to the reproductive knowledge in Spanish Purebred Horses: fertility, sperm vitrification and pregnancy monitorization
Autor
Requena Domenech, Fernando
Director/es
Agüera, Estrella I.Pérez-Marín, C.C.
Editor
Universidad de Córdoba, UCOPressFecha
2018Materia
EquinosCaballo PRE
Reproducción animal
Gestación
Fertilidad
Vitrificación
Criopreservación
METS:
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El caballo ha sido seleccionado atendiendo a sus éxitos deportivos más que a su tasa
de fertilidad. Por ello, el caballo se ha mostrado por tener una eficiencia reproductiva
más baja comparándolo con otras especies domésticas. Hay varios estudios sobre
eficiencia reproductiva en diferentes razas equinas, pero no en el Pura Raza Español
(PRE). Ésta, depende de factores relacionados con la yegua, el semental y factores
externos. Para determinar la fertilidad equina se han desarrollado cuatro artículos.
En el primer artículo, se determinaron los efectos de varios factores abióticos, como la
luz, el estrés físico (pipeteo) y el shock térmico en la calidad de esperma equino fresco
y refrigerado. En el experimento I, cuatro alícuotas de esperma fueron sometidas a
diferentes exposiciones de luz: (i) muestra control protegida (CTRL), (ii) expuesta a luz
ultravioleta a 10 cm (UV10), (iii) expuesta a luz ultravioleta a 20 cm (UV20cm) y (iv)
expuesta a la luz de laboratorio (LAB). En el experimento II, cuatro alícuotas de semen
fueron sometidas a pipeteo repetido durante 0, 10, 20 y 30 veces (CTRL, P10, P20, P30,
respectivamente). En el experimento III, cuatro alícuotas de semen a 15°C fueron
sometidas a oscilaciones térmicas: (i) esperma control refrigerado a 15°C (CTRL), (ii)
oscilaciones de 1.9°C/min a temperatura de 30°C (T30), (iii) oscilaciones de 1.4°C/min,
con un rápido descenso de temperatura hasta alcanzar 1.3°C (T0R) y (iv) oscilaciones
de 1.1°C/min, con un descenso de temperatura lento has alcanzar 4.2°C (T0S). Los
resultados revelaron que después de 30min, las muestras de esperma UV10 y UV20
mostraron significativamente (p < 0.05) los valores más bajos de motilidad total,
parámetros cinemáticos y potencial mitocondrial. Después de 45 min de exposición,
las diferencias fueron altamente significantes (p < 0.001). No se encontraron
diferencias significativas (p > 0.05) para el pipeteo y las oscilaciones térmicas. Los
resultados sugieren que, incluso si las muestras de esperma no son manejadas en el
laboratorio bajo condiciones óptimas, los espermatozoides de equino en fresco o
refrigerados son capaces de resistir el impacto de varios factores abióticos sin provocar
una reducción de su calidad. Este estudio analiza el efecto en muestras de esperma
normales, pero en el futuro la investigación podría buscar la tolerancia que las
muestras de esperma equino con astenospermia tendrían a la influencia de estos
factores abióticos.
En el segundo artículo se llevó a cabo una investigación para evaluar el impacto de
varios agentes crioprotectores (AC) y la vitrificación en la calidad del esperma. Un total
de 12 eyaculados fueron sometidos a la exposición de CPA y a vitrificación. El esperma
fue diluido en un rango de AC: fresco, control (BSA), sacarosa (0.15M, 0.3M y 0.5M),
trehalosa (0.15M, 0.3M y 0.5M) y la combinación de sacarosa y trehalosa (M1: 0.15M
sacarosa + 0.5M trehalosa; M2: 0.5M sacarosa + 0.15M trehalosa). La motilidad
espermática, viabilidad, integridad del acrosoma y la fragmentación del ADN fueron
evaluados en el momento de la exposición a los AC y después de la vitrificación. La
exposición de los espermatozoides a varias concentraciones de sacarosa y/o trehalosa
redujeron significativamente la motilidad espermática, aunque con bajas concentraciones resultaron en una motilidad más alta. La viabilidad espermática y la
fragmentación del ADN no variaron después de la exposición a los AC, pero la
integridad del acrosoma cayó significativamente cuando los espermatozoides fueron
expuestos a AC con alta osmolaridad. Cuando los espermatozoides fueron vitrificados,
los valores de motilidad fueron significativamente más altos que los obtenidos durante
la exposición a AC. La concentración baja de sacarosa (0.15M y 0.3M) y trehalosa
(0.15M) mostraron la mejor motilidad progresiva espermática. El procedimiento de
vitrificación-calentamiento redujo significativamente la viabilidad espermática y la
integridad del acrosoma, pero el ADN no varía con ninguno de los AC empleados. La
vitrificación del esperma equino demuestra una baja capacidad para preservar la
motilidad espermática, y los diluyentes que contienen trehalosa o sacarosa a bajas
concentraciones se asocian con un mejor efecto protector en la motilidad espermática.
Después de la vitrificación, el acrosoma y las membranas plasmáticas se dañaron
severamente, mientras la estructura del ADN se mantuvo. El espermatozoide equino
recobró la motilidad después de la vitrificación, pero se precisa realizar más estudios
en la preservación de las membranas espermáticas.
En el tercer artículo fueron establecidos los valores normales del espesor conjunto
útero-placenta (ECUP) en yeguas Pura Raza Española (PRE) durante el último periodo
de gestación. Un total de 107 yeguas fueron examinadas a los 210, 240, 270 y 300 días
de gestación, de las cuales 13 tuvieron gestaciones anormales (muerte fetal, abortos o
nacidos muertos). En yeguas con potros sanos, las medidas ECUP mostraron
diferencias significativas (P < 0.0001) en varias edades gestacionales (4.83 ± 0.59 mm,
6.12 ± 0.60 mm, 7.41 ± 0.61 mm y 10.45 ± 0.92 mm at 210, 240, 270 y 300 días,
respectivamente). Una alta correlación positiva se observó entre ECUP y la edad
gestacional (r = 0.923; P < 0.001). En yeguas con gestación anormal las medidas ECUP
fueron significativamente más altas (P < 0.0001) que en las gestaciones sanas en el día
270 (8.89 vs. 7.41 mm) y en el 300 (14.17 vs. 10.45 mm). La edad de la yegua, el
tiempo de fecundación, el tipo de semen y la longitud de la gestación no afectan la
ECUP. Los resultados obtenidos sugieren que el punto de corte para la detección
anormal de las gestaciones en yeguas PRE es 7.75 mm en el día 270 y 12.7 mm en el
día 300. La incidencia del aumento de ECUP en el último periodo de gestación de la
yegua PRE fue del 14% y un examen ecográfico transrectal a los 270 días de gestación
es muy aconsejable. La evaluación periódica placentaria podría revelar alteraciones no
detectadas por los demás, permitiendo instaurar tratamiento apropiados encaminados
a prevenir la pérdida fetal.
Finalmente, un estudio se llevó a cabo un estudio retrospectivo para determinar la
eficiencia reproductiva de la yegua PRE. Se evaluó la influencia de la edad, el estatus
reproductivo, la inseminación con semen refrigerado o congelado, el número de
inseminaciones por ciclo, el tipo de celo, el tipo de ovulación, la temporada
reproductiva, el año de la temporada reproductiva, la presencia de fluido uterino y la
edad del semental. Se incluyeron en una base de datos las inseminaciones de 122
yeguas PRE durante 4 temporadas reproductivas consecutivas (2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016). Un total de 359 ciclos fueron estudiados. Las yeguas se
agruparon de acuerdo a la edad: jóvenes, mediana edad, viejas y muy viejas y de
acuerdo al estatus reproductivo: vírgenes, infértiles, paridas y no cubiertas. Las tasas
de gestación más altas fueron con semen refrigerado en el primer ciclo (P < 0.05), en
todos los ciclos (P < 0.05), en el día 14 por temporada (P < 0.001) y en la tasa de partos
(P < 0.001). Las tasas de gestación y partos fueron significativamente influenciadas por
el efecto de la edad. Las yeguas jóvenes y vírgenes tuvieron las tasas de gestación más
altas. No hubo diferencias significativas (P > 0.05) en la tasa de gestación en todos los
ciclos cuando se analizó el número de inseminaciones por ciclo, tipo de celo, tipo de
ovulación, temporada reproductiva, año de la temporada reproductiva y la edad del
semental. Hubo diferencias significativas (P < 0.05) entre las yeguas que no
acumularon fluido uterino (58.13%) y las que acumularon fluido intrauterino antes de
la cubrición (42.35%) y después (25.00%). La yegua PRE podría ser considerada como
una raza de caballo muy fértil. Horse has been selected contemplating its sporting success more than its fertility rate.
For this reason, horse has been showed to have relatively lower reproductive
efficiency compared to others domestics species. There are many studies about
reproductive efficiency in different breeds horses but not in Spanish Purebred (SP)
horse. Equine reproductive efficiency depends on factors related to the mare, the
stallion and external factors. To determine equine fertility four articles were
developed.
In the first article, it was determined the effects of various abiotic factors, such as light,
physical stress (pipetting) and thermal shock, on the quality of fresh and cooled equine
sperm. In experiment I, four sperm aliquots were subjected to different light
exposures: (i) protected control samples (CTRL), (ii) exposed to UV light at 10 cm
(UV10), (iii) exposed to UV light at 20 cm (UV20) and (iv) exposed to laboratory lighting
(LAB). In experiment II, four semen aliquots were subjected to repeated pipetting for 0,
10, 20 and 30 times (CTRL, P10, P20 and P30, respectively). In experiment III, four
semen aliquots at 15°C were subjected to thermal oscillations: (i) cooled control sperm
at 15°C (CTRL), (ii) oscillations of 1.9°C/min to a temperature of 30°C (T30), (iii)
oscillations of 1.4°C/min, with the temperature rapidly falling until reaching 1.3°C (T0R)
and (iv) oscillations of 1.1°C/min, with the temperature slowly falling until reaching
4.2°C (T0S). The results revealed that after 30 min, UV10 and UV20 sperm samples
showed significantly (p < 0.05) lower total and progressive motility values, sperm
kinematic parameters and mitochondrial potential. After 45 min of exposure,
differences were highly significant (p <0.001). No significant differences (p > 0.05) were
found for pipetting or thermal oscillations. The results suggest that, even if equine
sperm samples are not handled in the laboratory under optimal conditions, fresh and
cooled equine spermatozoa are able to resist the impact of various abiotic stimuli
without any reduction in their quality. This study analyses the effect on normospermic
samples, but future research could look at the tolerance that asthenozoospermic
equine samples have to these abiotic influences.
In the second article was carried a research to evaluate the impact of various
cryoprotectant agents (CPA) and vitrification on equine sperm quality. A total of 12
ejaculates were subjected to exposure to CPA and vitrification. Sperm was diluted in a
range of CPA: fresh, control (BSA), sucrose (0.15M, 0.3M and 0.5M), trehalose (0.15M,
0.3M and 0.5M) and the combination of sucrose and trehalose (M1: 0.15M sucrose
+0.5M trehalose; M2: 0.5M sucrose+0.15M trehalose). Sperm motility, viability,
acrosome integrity and DNA fragmentation were assessed at the time of CPA exposure
and after vitrification. The exposure of spermatozoa to various concentrations of
sucrose and/or trehalose significantly reduced sperm motility, with lower concentrations resulting in higher sperm motility. Sperm viability and DNA
fragmentation did not vary after exposure to CPA, but acrosome integrity fell
significantly when spermatozoa were exposed to CPA with high osmolality. When
spermatozoa were vitrified, motility values were significantly higher than those
obtained during the exposure. Low concentrations of sucrose (0.15M and 0.3M) and
trehalose (0.15M) showed the best progressive sperm motility. The vitrificationwarmed
procedure significantly reduced sperm viability and acrosome integrity, but
DNA did not vary with any of CPA used. Equine sperm vitrification demonstrates a low
capacity for preserving sperm motility, and extenders containing trehalose or sucrose
at lower concentrations are associated with a better protective effect on sperm
motility. After vitrification, acrosome and plasma membranes were severely impaired,
while the DNA structure was maintained. Equine spermatozoa partially recover the
motility after vitrification, but there is a need for further studies into the preservation
of sperm membranes.
In the third study was established the normal values of the combined thickness of the
uterus and placenta (CTUP) in Spanish Purebred mares during late pregnancy. A total
of 107 mares were examined at 210, 240, 270 and 300 days of gestation, of which 13
had abnormal gestations (foetal death, abortion or stillbirth). In mares with healthy
foals, CTUP measurements showed significant differences (P < 0.0001) at the various
gestational ages (4.83 ± 0.59 mm, 6.12 ± 0.60 mm, 7.41 ± 0.61 mm and 10.45 ± 0.92
mm at 210, 240, 270 and 300 days, respectively). A high positive correlation was
observed between CTUP and gestational age (r = 0.923; P < 0.001). In mares with
abnormal gestation, CTUP measurements were significantly (P < 0.0001) higher than in
healthy gestations at day 270 (8.89 vs. 7.41 mm) and day 300 (14.17 vs. 10.45 mm).
The age of the mare, fertilization time, type of semen and gestation length did not
affect the CTUP. The results obtained suggest that the cut-off point for detecting
abnormal pregnancies in Spanish Purebred mares is 7.75 mm on day 270 and 12.7 mm
on day 300. The authors find that the incidence of placental thickness enlargement in
the late gestation of Spanish Purebred is 14%, and a transrectal ultrasonographic
examination is highly advisable at 270 days of gestation. Such timely placental
assessment could reveal otherwise undetected disorders, thereby enabling early and
proper treatments to be administered to prevent foetal loss.
Finally, a retrospective study was carried out to determine reproductive efficiency of
Spanish Purebred (SP) mare. It was evaluated the influence of age, reproductive status,
insemination with cooled or frozen semen, number of inseminations per cycle, type of
oestrus, type of ovulation, breeding season, year of breeding season, presence of
uterine fluid, stallions and stallion age. Records inseminations of 122 SP mares for four
consecutive breeding seasons (2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016). A total
of 359 cycles were studied. Mares were grouped according to age: young, middle aged, ageing and very old and to reproductive status: maiden, barren, foaling and
rested. Pregnancy rates were highest with cooled semen in the first cycle (P < 0.05), all
cycles (P < 0.05), day 14 pregnancies per season (P < 0.001), mares per season
(P < 0.001) and foaling rate (P < 0.001). Pregnancy and foaling rates were significantly
influenced by the effect of age. Young and maiden mares had highest pregnancy rates.
There were not significant differences (P > 0.5) in pregnancy rate in all cycles when
number of inseminations per cycle, type oestrus, type of ovulation, breeding season,
year of breeding season and stallion were analyzed. There were significant differences
between normal mares (58.13%) and mares with uterine fluid accumulation (P < 0.05)
before breeding (42.35%) or post-breeding (25.00%). SP mares could be considered
like a very fertile horse breed.