Nuevas estrategias en la preparación de la muestra y en el desarrollo de plataformas para el análisis metabolómico orientado y global

Abstract

La investigación realizada ha implicado: -Un estudio en profundidad de la bibliografía relacionada con el trabajo planteado, complementado con una actualización continua durante todo el desarrollo de la tesis para mantener la investigación en primera línea. Se prestó especial atención a temas relacionados con la preparación de la muestra y la metabolómica, incluyendo una herramienta comúnmente utilizada por el grupo de investigación al que pertenece la doctoranda: los ultrasonidos (US) usados como energía auxiliar para favorecer etapas analíticas. De hecho, la extracción asistida por US (USAE) [1], los US y la metabolómica [2] y el controvertido efecto de los US en la actividad enzimática [3] han dado lugar a tres publicaciones que constituyen la Sección A de la tesis. -La hidrólisis de la oleuropeína en extractos de hojas de olivo acelerada por diferentes hidrolasas y por la acción de los US (USAEH) [4] (que abre la puerta al complejo mundo del binomio enzimas–US), el uso de una plataforma basada en cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC–QTOF MS/MS) que proporcionó los datos para la identificación tentativa de 123 metabolitos de extractos que habían producido la inhibición de la proteasa NS3 del virus de la hepatitis-C [5] constituyen logros plasmados en publicaciones. Otro de los logros fue la exhaustiva identificación de los componentes de una planta controvertida, Cannabis sativa L., mediante plataformas basadas en cromatografía de gases–espectrometría de masas de tiempo de vuelo (GC–TOF/MS) y LC– QTOF MS/MS [6]. Estas investigaciones, que constituyen la Sección B de la tesis, abren nuevas líneas de trabajo en metabolómica vegetal. -El exhaustivo estudio de una muestra apenas usada en clínica, el sudor, que ha consistido en: (1) el desarrollo de procedimientos para el muestreo y la preparación de la muestra — los primeros basados en estimulación de la sudoración mediante ejercicio moderado, mediante la forma convencional basada en estimulación química+eléctrica y por disolución de sudor seco utilizando soportes sólidos impregnados de los disolventes adecuados. (2) El análisis metabolómico de los dos primeros tipos de muestras y su comparación con sudor obtenido mediante el último tipo de muestreo [8,9]; todo lo cual forma parte de la Sección C. En todos los casos, el análisis no dirigido permitió establecer el perfil del tipo de muestra que debe obtenerse dependiendo de los metabolitos de interés (compuestos polares, no polares o de polaridad media), que se sometieron a análisis no dirigido para su identificación tentativa en todos los tipos de sudor muestreado. La Sección C también recoge un estudio sobre muestreo de sudor después de ejercicio moderado, en el que se comparó su composición con la de sudor obtenido mediante muestreo pasivo utilizando diferentes procedimientos de inducción. Se ensayaron diferentes estrategias de preparación de muestra incluyendo estrategias de derivatización para obtener instantáneas representativas del metaboloma del sudor, especialmente de los metabolitos no polares, como corresponde al uso de una plataforma GC–MS [8]. Además, en la Sección C, se usaron como muestreadores de sudor seco diferentes soportes sólidos impregnados con diferentes disolventes y las composiciones de las muestras se compararon entre sí y también con la composición del sudor fresco. Todas las muestras se analizaron mediante dos plataformas, GC–MS y LC–MS/MS, y los resultados mostraron que el sudor seco es más adecuado para el análisis de los metabolitos de baja polaridad, mientras que el sudor fresco es más apropiado para compuestos polares [9]. La última de las investigaciones contenidas en la Sección C se refiere a aminoácidos existentes en sudor. Estos compuestos son metabolitos claves en la diagnosis y tratamiento de diversas enfermedades, como el cáncer, por lo que se determinan en diferentes biofluidos. La determinación cuantitativa de estos compuestos en sudor requirió la optimización de la preparación de la muestra que, dependiendo de la concentración, puede consistir en simple dilución o en microextracción centrífuga en fase sólida (c-SPμE) como etapa previa a la inserción en un cromatógrafo de líquidos conectado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo [7]. En los estudios de metabolómica clínica que se recogen en la Sección D se compararon diferentes estrategias de preparación de la muestra para la obtención del perfil de metabolitos en sudor con el uso de una plataforma GC–TOF/MS en modo de alta resolución [10]. La comparación mostró que una etapa de metoximación más sililación tras la desproteinización era la opción más adecuada para conocer la situación instantánea del metaboloma del sudor. También la Sección D recoge el estudio de muestras de sudor procedentes de dos cohortes de pacientes de cáncer de pulmón, analizadas mediante LC–QTOF MS/MS para configurar paneles de biomarcadores con los que discriminar estos pacientes de fumadores como individuos con factor de riesgo [11]. El uso de una herramienta como PanelomiX permitió reducir los falsos negativos (95% de especificidad) y los falsos positivos (95% de sensibilidad) y la proposición de dos paneles de biomarcadores: uno, con 96.9% de especificidad y 83.8% de sensibilidad, compuesto por el monoglicérido MG(22:2), los ácidos mucónico, subérico y urocánico y una tetrahexosa; el otro con 81.2% de especificidad y el 97.3% de sensibilidad, compuesto por el monoglicérido MG(22:2), los ácidos mucónico, nonanodioico y urocánico, y una tetrahexosa.

The performed research has involved: -An in-depth study of the literature related to the planned work, complemented with a continuous updating during the development of the target studies that will keep the research in the front line. Especial attention have been paid to sample preparation and metabolomics, including a tool commonly used by the PhD student research team: ultrasound (US) used as auxiliary energy to favor analytical steps. Thus, US-assisted extraction (USAE) [1], US and metabolomics [2] and the controversial effect of US on enzymatic activity [3] gave place to three publications that constitute Section A of the thesis. -The hydrolysis of oleuropein in olive leaf extracts accelerated by different hydrolases and by US action (USAEH) [4] (which opens the door to the complex enzymes–US world), and the use of a liquid chromatography–time-of-flight tandem mass spectrometry (LC–QTOF MS/MS) platform to obtain the data for tentative identification of 123 metabolites in extracts that had shown inhibition of the protease NS3 of hepatitis-C virus (HCV) [ 5] constitute key achievements. Another achievement was the in-depth identification of the components of a controversial plant, Cannabis sativa L., by gas chromatography–time-offlight mass spectrometry (GC–TOF/MS) and LC–QTOF MS/MS platforms [6]. All these investigations, which constitute Section B of the thesis, open new research lines in plant metabolomics. -An in-depth study of an almost not used sample in clinical, sweat, has consisted of : (1) the development of sampling and sample preparation procedures —the first ones based on sweat stimulation of sweat by moderate exercise, by the conventional via based on chemical+electrical stimulation and on dissolution of dry sweat by using solid supports impregnated with appropriate solvents. (2) The metabolomics analysis of the first two types of samples and their comparison with sweat obtained by the last kind of sampling [8,9]; all of which is part of Section C. The untargeted analysis in all cases allowed setting the pattern of the type of sample to be obtained depending on the metabolites of interest (polar, no polar or medium polarity compounds), all which were subjected to untargeted analysis for tentative identification in all types of sampled sweat. Section C also includes a study on sweat sampling after moderate exercise, in which the composition of this biofluid was compared with that of sweat obtained by passive sampling using different sweat induction procedures. Different sample preparation strategies, including derivatization strategies, were assayed to obtain a representative snapshot of sweat metabolome, mainly of no polar metabolites as corresponds to the use of a GC–MS platform [8]. Moreover, different solid supports impregnated with different solvents were used as dry sweat samplers and the composition of the collected samples was compared among them, and also with the composition of fresh sweat. All the samples were analyzed by a dual approach, GC–MS and LC–MS/MS, and the results showed that dry sweat is better for analysis of low polar metabolites and fresh sweat is more suited for polar compounds [9]. The last of the research contained in Section C refers to amino acids existing in sweat. These compounds are key metabolites in the diagnosis and treatment of several diseases such as cancer; therefore, they are determined in common biofluids. Quantitative determination of these compounds in sweat has required optimization of the sample preparation step which, depending on the concentration, can consist either on simple dilution or centrifugal microsolid-phase extraction (c-SPμE) prior to insertion into a liquid chromatograph connected to a triple quadrupole mass detector [7]. In the clinical metabolomics studies that constitute Section D, different sample preparation strategies were compared to obtain the profile of sweat metabolites by a GC– TOF/MS platform in high resolution mode [10]. The comparison showed that methoxymation plus silylation after deproteination was the most suited option to obtain a representative snapshot of sweat metabolome. Section D also contains the study of sweat samples, from two cohorts of lung-cancer patients, subjected to analysis by LC–QTOF MS/MS to configure biomarker panels to discriminate these patients from smokers as risk factor individuals [11]. The use of the PanelomiX tool allowed reducing false negatives (95% specificity) and false positives (95% sensitivity), and proposing two biomarker panels: one, with 96.9% specificity and 83.8% sensitivity, composed by monoglyceride MG(22:2), muconic, suberic and urocanic acids and a tetrahexose; and the other with 81.2% specificity and 97.3% sensitivity, and composed by monoglyceride MG(22:2), muconic, nonanodioic and urocanic acids, and a tetrahexose.