Development of microbial interaction predictive models for Listeria monocytogenes and lactic acid bacteria and their application for the optimization of bio-protective cultures in fishery products

Abstract

Minimally processed and ready-to-eat (RTE) fish products that have not undergone any lethal treatment prior to consumption represents for a potential risk of pathogenic microorganisms, such as Vibrio spp. and Listeria monocytogenes. These pathogens cause foodborne infections resulting from consumption of contaminated raw fish or partially cooked fish or products contaminated during food handling and preparation. The genus Vibrio are environmentally ubiquitous in estuarine or marine water, able to reach consumers when products are not properly cooked, while the ability of L. monocytogenes to re-contaminate RTE products, during food handling and processing, and multiply at refrigeration temperatures poses a significant risk to human health. The microbial behaviour in food can be described using predictive mathematical models, taking into account the processing, distribution and home conditions along the food chain. In the first section of this work, an extensive review was elaborated, including the main aspects and concepts covered by the present thesis, which comprise of, among others, information on the aquaculture sector in Andalusia, relevant pathogenic and spoilage microorganisms in fishery products, listeriosis incidence, the use of bioprotective cultures or microbial risk assessment (Chapter 1). In addition, predictive microbiology tools were reviewed, providing an overview of the predictive modelling process, in particular, focused on microbial interaction models, and its application to quantitative microbial risk assessment (QMRA) (Chapter 2). In the experimental and investigation part, the microbiota and foodborne pathogens of Gilthead sea bream (Sparus aurata) and Sea bass (Dicentrarchus labrax) in two estuarine ecosystems were characterized and the shelf-life of both products was estimated using predictive models. Noteworthy, Vibrio parahaemolyticus was isolated from estuarine water and the initial microbiological quality of fish species and estuarine water was demonstrated to impact on product shelf-life (Chapter 3). For the study of biopreservation technology, lactic acid bacteria (LAB) strains were used to inhibit the growth of L. monocytogenes. The data obtained from this study were used to develop predictive microbiology models, able to describe the microbial interaction of both microorganisms in culture media (Chapter 4) and filleted Gilthead sea bream under modified atmosphere packaging at isothermal and non-isothermal conditions (Chapter 5). As result of these studies, an innovative stepwise modelling process was designed to generate predictive models describing interaction of BAL and L. monocytogenes based on the combination of mono and co-culture growth data. In the case of the assay with Lactobacillus sakei CTC494, recognized as a bacteriocin-producing strain, it was evidenced that this bioprotective culture induced an early stationary phase of L. monocytogenes (Chapter 5), inhibiting the pathogen growth or reducing its concentration (Chapter 5). These experiments also confirmed that L. sakei CTC494 could be used, at a level of 4 log cfu/g, as bioprotective culture against L. monocytogenes in the abovementioned Gilthead sea bream product, without negatively affecting the sensory quality of the product. Furthermore, the interaction models generated for this bioprotective culture demonstrated an optimal prediction capacity of the inhibitory effect of L. sakei CTC494 on the pathogen in the fish product (Chapter 5). Overall, results of this work demonstrated the potential of using bioprotective cultures to control L. monocytogenes growth in Mediterranean fish products and enhance product shelf-life. In addition, the approach based on predictive microbiology was shown to be a suitable and effective method to simulate the simultaneous growth of bacteriocinproducing LAB strains and L. monocytogenes in culture media and fish products, presenting itself as a tool for supporting the design and optimization of preservation strategies based on the use bioprotective cultures in minimally processed and RTE fish products.

Los productos pesqueros mínimamente procesados y listos para el consumo (RTE) sin tratamiento letal previo al consumo representan un riesgo potencial de presencia de microorganismos patógenos de transmisión alimentaria, como podrían ser Vibrio spp. y Listeria monocytogenes. Esos patógenos pueden estar presentes en el pescado crudo contaminado o pescado parcialmente cocido o bien recontaminarlo durante su manipulación y preparación. Los patógenos del género Vibrio tienen su origen en aguas de estuario o marinas, y pueden llegar hasta el consumidor, si el alimento no ha sido cocinado adecuadamente, mientras que L. monocytogenes puede contaminar los productos RTE, por contaminación cruzada, y multiplicarse a temperaturas de refrigeración, representando, por ello, un riesgo significativo para la salud humana. El comportamiento de los microorganismos en los alimentos puede describirse utilizando modelos matemáticos de microbiología predictiva, considerando las condiciones de procesado, de distribución y de la fase de consumo, cubriendo toda la cadena alimentaria. El propósito de la presente tesis doctoral fue estudiar y cuantificar el efecto bio-protector de cultivos bacterianos seleccionados sobre patógenos alimentarios y optimizar su diseño y uso en productos pesqueros RTE, mediante un enfoque de microbiología predictiva. Para ello, en primer lugar, se abordó una extensa revisión sobre los principales aspectos y conceptos objeto del presente trabajo, incluyendo información sobre el sector de la acuicultura en Andalucía, los tipos de microorganismos patógenos y alterantes de relevancia en productos pesqueros, la incidencia de listeriosis, el uso de cultivos bioprotectores y la evaluación del riesgo microbiano (Capítulo 1). A su vez, se realizó un análisis de las herramientas de microbiología predictiva, proporcionando una descripción general de los procesos de generación de modelos matemáticos, en particular, de modelos de interacción microbiana y de su aplicación en la evaluación cuantitativa del riesgo microbiano (ECRM) (Capítulo 2). En la parte experimental y de investigación del trabajo, se realizó un estudio de caracterización de la microbiota y patógenos alimentarios de la Dorada (Sparus aurata) y Lubina (Dicentrarchus labrax) en dos ecosistemas de estuario, estimándose la vida útil de los productos pesqueros mediante modelos predictivos. Es destacable la presencia de Vibrio parahaemolyticus, que se aisló de agua de estuario, además del impacto demostrado de la calidad microbiológica de las especies pesqueras y del agua en el que se encuentran sobre la vida útil del producto (Capítulo 3). En la parte que estudió y aplicó las tecnologías de bioconservación, se utilizaron cepas de bacterias ácido-lácticas (BAL) para inhibir el crecimiento de L. monocytogenes. Los datos obtenidos sirvieron para generar modelos de microbiología predictiva que permitieron describir, adecuadamente, la interacción microbiana entre ambos microrganismos en medios de cultivo (Capítulo 4) y en productos de filetes de Dorada envasados en atmósfera modificada bajo condiciones isotérmicas y no isotérmicas (Capítulo 5). Como resultado de estos estudios, se diseñó un proceso sistematizado, basado en etapas, para la generación de modelos de interacción entre BAL y L. monocytogenes, combinando datos de crecimiento de mono y cocultivo en caldo y en alimento. En el caso de los experimentos con la cepa de Lactobacillus sakei CTC494, reconocida como productora de bacteriocina, se pudo observar que esta indujo una fase estacionaria temprana sobre el crecimiento de L. monocytogenes (Capítulo 5), reduciendo su crecimiento o, incluso, disminuyendo su concentración. Estos experimentos también confirmaron que L. sakei CTC494 podría aplicarse, a un nivel de 4 log ufc/g, como cultivo bioprotector contra L. monocytogenes en el producto de Dorada previamente mencionado, sin afectar negativamente la calidad sensorial del producto. Además, los modelos de interacción generados para este cultivo mostraron una buena capacidad de predicción del efecto bioprotector de L. sakei CTC494 sobre el patógeno en el producto de Dorada fileteada (Capítulo 5). En general, los resultados de la tesis doctoral demostraron el gran potencial de los cultivos bioprotectores para controlar el crecimiento de L. monocytogenes en productos pesqueros del mediterráneo y mejorar su vida útil. Se comprobó, además, que el enfoque, diseñado en el presente trabajo, basado en la utilización de modelos de interacción microbiana, fue un método valido y efectivo para simular el comportamiento simultáneo de diferentes cepas de BAL, productoras de bacteriocina, y L. monocytogenes en medios de cultivo y productos pesqueros, proponiéndose, por tanto, como una herramienta de gran valor para el diseño y optimización de estrategias de conservación basadas en el uso de cultivos bioprotectores en pescados mínimamente procesados y RTE productos.