Innovaciones nanotecnológicas en el desarrollo de plataformas analíticas para la evaluación de la seguridad agroalimentaria

Abstract

Esta Tesis Doctoral ha tenido como objetivo el desarrollo de plataformas analíticas de respuesta rápida para su aplicación en análisis agroalimentario con el uso de nanoestructuras incorporadas como herramientas analíticas con diferente finalidad utilizando sistemas dinámicos convencionales o implementados a escala micrométrica. Para ello, se han incluido innovaciones en los métodos de síntesis de dichas nanoestructuras, así como en el empleo de plataformas analíticas separativas con diferente fundamento para su separación y caracterización. Entre las nanoestructuras desarrolladas se encuentran diversos tipos de nanopartículas (NPs) y bicapas lipídicas (liposomas), así como de nanomateriales de carbono bidimensional, como grafeno. Entre las NPs sintetizadas, cabe destacar las NPs híbridas, principalmente tipo core-shell de NPs metálicas de oro con un núcleo magnético de NPs de óxidos de hierro, cuya superficie se ha modificado para conferirles carácter hidrofóbico (Fe3O4@AuNPs-C12SH). Los liposomas son estructuras autoensambladas cuya utilidad como contenedores analíticos favorece diferentes funcionalidades a lo largo del proceso analítico. Por una parte, la incorporación de las NPs, formando magnetoliposomas (MLs), los dotan de capacidad de retención magnética en la zona de reacción/detección de las plataformas analíticas determinativas desarrolladas. Por otra parte, el encapsulamiento de diferentes ingredientes involucrados en las reacciones analíticas o indicadoras, ejercen una importante función protectora y/o amplificadora respecto al desarrollo de la reacción analítica y la monitorización de la señal instrumental. Los nanomateriales de carbono bidimensional, en especial el grafeno, son buenos candidatos para proporcionar una fina capa receptora. Como este material tiene un átomo de espesor y posee grandes áreas de hibridación sp2, se ha usado para la inmovilización de reactivos y así originar superficies activas en el desarrollo de plataformas analíticas biosensoras. Uno de los retos a conseguir respecto a la seguridad alimentaria se orienta hacia el desarrollo de metodologías que posibiliten la determinación de residuos de sustancias químicas tipificadas como xenobióticos en el área del análisis de alimentos. Se evidencia una demanda tecnológica para desarrollar metodologías analíticas más rápidas, sensibles, selectivas y precisas para la monitorización de residuos de xenobióticos. La aplicabilidad de las investigaciones desarrolladas se ha orientado hacia la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en alimentos. Se han propuesto diferentes opciones de plataformas analíticas determinativas basadas en el uso de sistemas dinámicos a escala microfluídica en las que se han integrado diferentes sistemas instrumentales para el seguimiento de las reacciones analíticas estudiadas. Contenido de la investigación El objetivo genérico de las investigaciones propuestas en esta Tesis Doctoral ha sido implementar diferentes innovaciones nanotecnológicas para su incorporación en las nuevas plataformas analíticas diseñadas que permitan aportar información para la evaluación de la calidad agroalimentaria. Este objetivo genérico se ha subdividido en tres objetivos específicos que quedan reflejados en los tres apartados en que se ha estructurado el desarrollo transversal de las investigaciones realizadas: (a) Síntesis, separación y caracterización de los materiales y/o nanoestructuras a incorporar en las diferentes partes de los sistemas dinámicos, ya sea como dispositivos de anclaje e integración instrumental, como elementos que Monitorización mediante un sistema de flujo continuo con detección luminiscente del resultado de la separación de poblaciones de liposomas mediante MDGC posterior a la síntesis de MLs híbridos en los que han encapsulado Fe3O4@AuNPs-C12SH y distintos fluoróforos [2]. - Separación y caracterización de las distintas poblaciones obtenidas después de la síntesis de varios tipos de liposomas utilizando la técnica AF4-MALS y la comparación de los resultados obtenidos con otras técnicas, como TEM y DLS [3]. En el Bloque II se ha desarrollado una plataforma analítica para monitorizar el resultado de la separación MDGC de los liposomas híbridos sintetizados por acoplamiento a un sistema microfluídico que se ha integrado en el sistema de detección, un espectrofluorímetro convencional, mediante el uso de un dispositivo de anclaje y focalización fabricado mediante tecnología de impresión 3D. Este bloque a dado lugar a una publicación: - Integración de un sistema microfluídico en un detector luminiscente convencional usando un dispositivo de alineamiento diseñado y obtenido por impresión 3D. En el sistema también se integra el dispositivo de retención magnética y los elementos de focalización de la radiación incidente [4]. Finalmente, en el Bloque III se han propuesto dos metodologías analíticas (bio)sensoras para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en alimentos. Se ha descrito dos plataformas analíticas en dos publicaciones: - Desarrollo de un biosensor aptamérico basado en la unión covalente del aptámero a grafeno depositado sobre una superficie de oro para la determinación de residuos de kanamicina en alimentos mediante monitorización de la dispersión basada en la técnica de resonancia del plasmón superficial (SPR) [5]. - Desarrollo de una plataforma analítica sensora a escala micrométrica para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos basada en la integración de la zona de reacción/detección en un dispositivo microfluídico con retención electromagnética de parte de los ingredientes de la reacción analítica por encapsulación en MLs híbridos y detección fluorimétrica. La integración del sistema microfluídico en el compartimento de muestra de un espectrofluorímetro convencional se realiza mediante el sistema de anclaje construido mediante tecnología de impresión 3D [6]. Conclusiones En la presente Memoria se han desarrollado diferentes plataformas analíticas separativas y/o determinativas con diferente grado de integración con sistemas dinámicos de flujo convencional o desarrollados a escala microfluídica, para la monitorización de la eficacia en la separación de los nanomateriales híbridos sintetizados, así como para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en alimentos. A continuación, se resumen las conclusiones más relevantes de las investigaciones realizadas: 1. Se han sintetizado y caracterizado diferentes tipos de nanomateriales híbridos, mediante modificaciones innovadoras de métodos clásicos. Cabe destacar los siguientes nanomateriales: - NPs híbridas con estructura core-shell con un núcleo de magnetita recubiertas con NPs de oro y haciendo su superficie hidrofóbica (Fe3O4@AuNPs-C12SH), que se han utilizado para su incorporación en la bicapa lipídica para formar MLs. - Liposomas híbridos sintetizados mediante la metodología de evaporación rápida de disolvente (RSE), permitiendo la incorporación de materiales con diferente funcionalidad a lo largo del proceso analítico. El encapsulamiento de estos materiales diversos dentro de los liposomas ha aportado aspectos innovadores en las metodologías desarrolladas, aportando una gran utilidad como contenedores analíticos: a) como dispositivos de transporte y de protección del material encapsulado a lo largo del proceso analítico, especialmente de compuestos involucrados en las reacciones analíticas, b) como dispositivos con capacidad magnética que facilita su retención en zonas claves de reacción/detección del proceso (bio)analítico, y c) como dispositivo con funciones de amplificación de la señal instrumental, ya que permiten el atrapamiento/liberación de reactivos preconcentrados en el interior de la vesícula lipídica. - Nanomateriales de carbono bidimensional (grafeno) utilizados como estructura base para la inmovilización de aptámeros selectivos en el diseño de un sensor aptamérico en continuo con detección mediante SPR. 2. Se han desarrollado diferentes plataformas analíticas separativas que permiten monitorizar el rendimiento de la eficacia en la separación de los nanomateriales sintetizados y de los residuos originados después de los procesos de síntesis. El proceso de separación se ha llevado a cabo mediante el uso de la metodología MDGC. Se ha estudiado el empleo de diferentes materiales con capacidad separativa en base a su efecto sobre la velocidad de sedimentación, así como el establecimiento de diferentes perfiles en el gradiente de centrifugación. Se han desarrollado dos tipos de plataformas separativas basadas en el empleo de sistemas dinámicos de flujo continuo a escala convencional y a escala micrométrica. Se han empleado diferentes sistemas de monitorización de la señal instrumental con diferente fundamento en función del tipo de nanomaterial separado, ya sea mediante medida de la dispersión de la radiación o mediante medida de la emisión luminiscente de los fluoróforos involucrados. 3. Se han separado diferentes poblaciones de liposomas híbridos mediante el uso de la técnica AF4-MALS. 4. Se ha establecido por primera vez una plataforma analítica integrada mediante el acoplamiento de un sistema microfluídico en el compartimento de muestra de un espectrofluorímetro convencional mediante el uso de un dispositivo de anclaje y focalización fabricado mediante tecnología de impresión 3D. Esta plataforma analítica se ha utilizado para la monitorización del resultado de la separación mediante MDGC de diferentes tipos de liposomas híbridos sintetizados. 5. Se ha desarrollado una plataforma analítica fundamentada en un biosensor aptamérico para la determinación de kanamicina en leche mediante la integración de nanomateriales de carbono bidimensional de grafeno depositado en la monocapa de oro situada en la superficie sensora del sistema de flujo acoplado en un detector de plasmón de resonancia superficial. 6. Se ha demostrado la utilidad de una plataforma analítica microfluídica integrada mediante tecnología 3D dentro de detectores luminiscentes convencionales en la que se han incorporado MLs híbridos (que contienen Fe3O4@AuNPs-C12SH y N-acetilcisteína) para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en muestras de alimentos, utilizando a su vez o-ftalaldehído como reactivo derivatizante.

The aim of this Doctoral Thesis has been developing analytical platforms with a rapid response for their application in agri-food analysis with the use of incorporated nanostructures as analytical tools with different purposes using conventional dynamic systems or implemented at a micrometric scale. For this, some innovations in the synthesis methods of mentioned nanostructures and separative analytical platforms with a different basis for their separation and characterization have been developed. Among the developed nanostructures are various types of nanoparticles (NPs) and lipid bilayers (liposomes), and two-dimensional carbon nanomaterials, like graphene. Among the NPs synthesized the hybrid NPs must be highlighted, mainly coreshell type composed of metallic gold NPs with a magnetic core of iron oxides NPs, whose surface has been modified to provide them hydrophobic character (Fe3O4@AuNPs-C12SH). Liposomes are self-assembled structures whose usefulness as analytical containers favors different functionalities throughout the analytical process. On the one hand, the NPs incorporation, forming magnetoliposomes (MLs), endow them with magnetic retention capability in the reaction/detection zone of the developed determinative analytical platforms. On the other hand, the encapsulation of different ingredients involved in analytical or indicator reactions plays an important protective and/or amplifying function concerning the reaction development and instrumental signal monitoring. Twodimensional carbon nanomaterials, especially graphene, are good candidates for providing a thin receptor layer. As this material is one atom thick and has large sp2 hybridization areas, it has been used to immobilize reagents and originate active surfaces in the development of biosensor analytical platforms. One of the challenges concerning food safety is oriented towards developing methodologies that determine chemical substance residues classified as xenobiotics in the food analysis area. There is a technological demand to develop faster, more sensitive, selective, and precise analytical methodologies for monitoring xenobiotic residues. The applicability of the developed investigations has been oriented to determine aminoglycoside antibiotic residues in food. Different options of determinative analytical platforms based on conventional dynamic systems and on a microfluidic scale in which the integration of different instrumental systems for monitoring developed analytical reactions have been proposed. Research content The generic objective of the research proposed in this Doctoral Thesis has been to implement different nanotechnological innovations for their incorporation into the new analytical platforms designed to provide information for the agri-food quality evaluation. This generic objective has been subdivided into three specific objectives according to the three sections in which the transversal development of the research has been structured: (a) Synthesis, separation, and characterization of the materials and/or nanostructures to be incorporated in the different parts of dynamic systems, either as anchoring and instrumental integration devices, as elements that favor the nanostructures or reagents retention, or as reagents that participate in the involved chemical reactions. (b) Proposal of analytical platforms with a separative and/or determinative character based on the coupling in a conventional continuous system or on a microfluidic scale provides information about the result of the nanomaterials separation after their synthesis. (c) Demonstration of the analytical potential of the platforms developed for the evaluation of agri-food safety. This Thesis Book has been structured in three blocks, preceded by an Introduction. Then, some fundamental aspects related to the studied contents have been discussed, and a section with the main instrumental and methodological Tools for developing analytical platforms and their application in agri-food analysis. In this context, the following research has been included in the Experimental Part: Block I is focused on the synthesis, separation, and characterization of different nanomaterials used throughout the developed research. For that, two methodologies in which the result of the nanomaterials separation, based on a different fundament, has been coupled to detection systems for its monitoring and the characterization of the separated nanomaterials. As a result, this block has resulted in the following publications: - Development of a separation method using multiphase density gradient centrifugation (MDGC) for core-shell hybrid NPs with a magnetite core coated with gold NPs and a hydrophobic surface (Fe3O4@AuNPs- C12SH). The separation has been monitored by coupling the separation vial to a continuous flow analysis system with resonance light scattering detection [1]. - Monitoring by a continuous flow system with luminescent detection of the separation result of liposome populations by MDGC after the synthesis of hybrid MLs in which Fe3O4@AuNPs-C12SH and different fluorophores have been encapsulated [2]. - Separation and characterization of the different populations obtained after synthesizing various types of liposomes using the AF4-MALS technique and the comparation of the acquired results with other techniques, such as TEM and DLS [3]. In Block II, an analytical platform has been developed to monitor the result of the MDGC separation of the synthesized hybrid liposomes by coupling to a microfluidic system integrated into the detection system, a conventional spectrofluorimeter, using anchoring and focusing device manufactured using 3D printing technology. This block has led to a publication: - Integration of a microfluidic system in a conventional luminescent detector using an alignment device designed and obtained by 3D printing. The magnetic retention device and elements for focusing the incident radiation have also been integrated into the system [4]. Finally, in Block III, two (bio)sensor analytical methodologies have been proposed to determine aminoglycoside antibiotic residues in food. Two analytical platforms have been described in two publications: - Development of an aptameric biosensor based on the aptamer covalent binding to graphene deposited on a gold surface to determine kanamycin residues in food by monitoring the dispersion based on the surface plasmon resonance (SPR) technique [5]. - Development of a micrometric-scale sensor analytical platform to determine aminoglycoside antibiotic residues based on integrating the reaction/detection zone in a microfluidic device with electromagnetic retention of part of analytical reaction ingredients by their encapsulation in hybrid MLs and fluorimetric detection. The integration of the microfluidic system in the sample compartment of a conventional spectrofluorimeter is performed by the anchoring system built by 3D printing technology [6]. Conclusions In this Thesis Book, different separative and/or determinative analytical platforms have been developed with different degrees of integration with a conventional dynamic flow or microfluidic systems to monitor the efficiency of the synthesized hybrid nanomaterials separation and for determining aminoglycoside antibiotic residues in food. The most relevant conclusions of the research carried out are summarized below: 1. Different types of hybrid nanomaterials have been synthesized and characterized through innovative modifications of classical methods. The following nanomaterials should be highlighted: - Core-shell hybrid NPs with a magnetite core coated with gold NPs and a hydrophobic surface (Fe3O4@AuNPs-C12SH) have been used to incorporate them into the lipid bilayer to form MLs. - Hybrid liposomes synthesized using the rapid solvent evaporation (RSE) methodology, allowing the incorporation of materials with different functions throughout the analytical process. Furthermore, the encapsulation of these different materials within liposomes has provided innovative aspects in the developed methodologies, giving great usefulness as analytical containers: a) as transport and protection devices for encapsulated material through the analytical process, especially of compounds involved in the analytical reactions, b) as containers with magnetic properties that allow their retention in key reaction/detection areas of the (bio)analytical process, and c) as devices with amplification of the instrumental signal functions, since they allow the entrapment/release of pre-concentrated reagents inside the lipid vesicle. - Two-dimensional carbon nanomaterials (graphene) are used as a base structure for the immobilization of selective aptamers to design a continuous aptameric sensor with SPR detection. 2. Different separative analytical platforms to monitor the efficiency of the synthesized nanomaterials separation and the residues originated after the synthesis process have been developed. The separation process has been carried out by the MDGC method. Different materials with separative capacity related to their effect in the sedimentation rate and the different separation profiles establishment in the centrifugation gradient have been studied. Two types of separative platforms based on dynamic continuous flow systems at conventional and microfluidic scales have been developed. Different instrumental signal monitoring systems with different bases depending on the separated nanomaterial have been used, either by measuring the resonance light scattering or the luminescent emission of the involved fluorophores. 3. Different liposome populations by using the AF4-MALS technique have been separated. 4. An integrated analytical platform has been established for the first time by coupling a microfluidic system in the sample compartment of a conventional spectrofluorimeter using an anchoring and targeting device manufactured by 3D printing technology. This analytical platform has been applied to monitor the MDGC separation result of different synthesized hybrid liposomes. 5. An analytical platform based on an aptameric biosensor to determine kanamycin in milk has been developed by integrating graphene twodimensional carbon nanomaterials deposited in the gold monolayer of the sensor surface of the flow system coupled in a surface plasmon resonance detector. 6. The usefulness of a microfluidic analytical platform integrated by 3D technology into conventional luminescent detectors in which hybrid MLs (containing Fe3O4@AuNPs-C12SH and N-acetylcysteine) have been incorporated for the determination of aminoglycoside antibiotic residues in food samples has been demonstrated, using o-phthalaldehyde as derivatization reagent.