Aportaciones de la histopatología y de la histología molecular al diagnóstico e inmunopatogenia de la tuberculosis animal

Abstract

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por el complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) que afecta tanto al humano como a una amplia gama de especies animales, incluidos animales domésticos y silvestres. En salud pública es una de las principales causas de muerte por enfermedades infecciosas en el mundo. En los animales, es una de las enfermedades más importantes para el sector ganadero a nivel mundial, ya que produce decaimiento, anorexia y pérdida de peso lo que conlleva a grandes pérdidas económicas por el sacrificio de animales enfermos. Posee además un potencial zoonósico, ya que algunas cepas del CMT pueden transmitirse al humano lo que representa un riesgo para salud pública. El control de la TB animal es esencial para prevenir la transmisión a humanos y reducir la carga de la enfermedad en ambas poblaciones. Esto implica la aplicación de medidas de bioseguridad, detección temprana de animales infectados, sacrificio de animales enfermos y prácticas de higiene adecuadas en la producción y manipulación de productos de origen animal. Es importante señalar que los detalles y enfoques específicos de la gestión de la TB en los animales pueden variar según el país o la región y la especie animal de que se trate. Deben consultarse las autoridades y las directrices veterinarias locales para obtener información precisa y actualizada sobre la TB en los animales. Considerando lo anteriormente descrito, la presente tesis doctoral se centra en la puesta en valor de la histopatología como herramienta complementaria al diagnóstico de la TB y la expresión de diferentes marcadores de interés en nódulos linfáticos (NLs), así como la aproximación a la histología molecular en busca de profundizar en la inmunopatogenia de la TB en bovinos y porcinos infectados naturalmente con el CMT. El primer estudio de esta tesis evalúa el uso de la histopatología como herramienta complementaria para el diagnóstico de la tuberculosis bovina (TBb): así, de un total de 230 bovinos sometidos al programa de control y erradicación de TBb en España se cogieron muestras de sangre (212) y NLs (681) para análisis serológicos, bacteriológicos e histopatológicos. Setenta y un NLs y 59 bovinos resultaron positivos para bacteriología, y 59 NLs y 48 bovinos resultaron positivos en la PCR a tiempo real a partir de tejido fresco. Aproximadamente el 19 % (40/212) de las muestras de suero fueron positivos a ELISA. Se observaron lesiones tipo tuberculosas en el 11,9 % (81/681) de los NLs y el 30,9 % (71/230) de los bovinos. Sin embargo, en 18 de 83 animales SIT/PCR/cultivo negativo, de los cuales 11/18 fueron positivos a la técnica de Ziehl-Neelsen y dos de ellos positivos a la PCR digital (dPCR) IS6110. Seis de estos 11 ZN+ correspondían a NLs mesentéricos y se confirmaron positivos a paratuberculosis. La histopatología proporcionó una sensibilidad del 91,3 % (IC95: 83,2 - 99,4 %) y una especificidad del 84,4 % (IC95: 78,6 - 89,3 %) con una buena concordancia (k = 0,626) en comparación con la PCR en tiempo real. Nuestros resultados señalan el importante papel que desempeña la histopatología en el diagnóstico y control de la TBb, y destaca la necesidad de considerar esta técnica junto al uso de otras herramientas de diagnóstico para un mejor control de la enfermedad. El segundo estudio consiste en analizar la polarización de los macrófagos en granulomas de NLs de ganado vacuno y porcino procedentes de animales infectados naturalmente por el CMT. Los granulomas tuberculosos se clasificaron microscópicamente en 4 estadios y se analizaron mediante inmunohistoquímica utilizando un panel de marcadores de células mieloides (CD172a/MAC387), polarización de macrófagos M1 (iNOS/CD68/CD107a) y polarización de macrófagos M2 (Arg1/CD163). Los resultados mostraron que CD172a y MAC387 siguieron una misma cinética, siendo la expresión de este último mayor en los granulomas de fase tardía en cerdos. Del panel M1, la expresión de iNOS y CD68 prevaleció en bovino comparado con el porcino, siendo la expresión mayor en granulomas de estadio temprano. El marcaje frente a CD107a sólo se observó en los granulomas porcinos, con una mayor expresión en los granulomas de estadio I. Para el panel M2, la expresión de células Arg1+ fue significativamente mayor en porcino que en bovino, particularmente en granulomas de estadio tardío. El análisis cuantitativo de las células CD163+ mostró una cinética similar en ambas especies con una frecuencia consistente de células inmunomarcadas a lo largo de los diferentes estadios del granuloma. Nuestros resultados indican que la polarización de macrófagos M1 predomina en el ganado Resumen – Summary vacuno durante los granulomas en estadios iniciales (I y II), mientras que también se observa un fenotipo M2 en estadios posteriores. Por el contrario, y debido principalmente a la expresión de Arg1, la polarización de macrófagos M2 es predominante en todos los estadios de granuloma del cerdo. El tercer estudio se centra en comparar la firma proteica de granulomas en NLs pertenecientes a bovinos y cerdos infectados naturalmente por el CMT mediante MALDI-MSI, identificando la potencial participación de estas proteínas en vías biológicas e inmunológicas activadas a lo largo de la enfermedad, así como aquellas expresadas diferencialmente entre bovinos y cerdos. Para esto, se utilizaron muestras de 4 NLs de bovinos y porcinos con presencia de granuloma tuberculoso y, positivos al CMT por cultivo bacteriológico y/o PCR a tiempo real. Las imágenes de MALDI-MSI se realizaron utilizando un espectrómetro de masas AB-Sciex 5800 MALDI TOF/TOF (AB Sciex, Alemania). Los resultados mostraron una clara separación entre las masas de bovino y porcino, evidenciado un proteoma diferente en los granulomas de ambas especies. Sorprendentemente, algunos términos Gene Ontology (GO) coincidieron en ambas especies, presentando algunas proteínas en común. Es así como algunos de los términos GO que se encontraron fueron: “Complement activation” se observó en ambas especies, mientras que GO "Natural killer cell degranulation" se observó en bovinos y "Negative regulation of natural killer cell-mediated immunity" en porcinos. Estos resultados aportan nuevos conocimientos sobre la respuesta inmunitaria del huésped en la TB de bovinos y porcinos, destacando la importancia de la vía de activación del complemento y la regulación de la inmunidad mediada por células NK en la lucha contra la infección tuberculosa.

Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), which affects both humans and a wide range of animal species, including domestic and wild animals. In the field of public health, it stands as one of the primary causes of death due to infectious diseases worldwide. Among animals, it holds immense significance for the global livestock sector, as it induces wasting, anorexia, and weight loss, ultimately resulting in substantial economic losses due to the culling of sick animals. Furthermore, it carries a zoonotic potential, as certain strains of MTC can be transmitted to humans, thereby posing a public health risk. The control of animal TB is essential to prevent its transmission to humans and to reduce the disease burden in both populations. This entails implementing biosecurity measures, early detection of infected animals, culling of diseased animals, and adhering to proper hygienic practices in the production and handling of animal products. It is important to note that the specific details and approaches to TB management in animals may vary depending on the country or region and the animal species involved. Local veterinary authorities and guidelines should be consulted for accurate and up-to-date information on TB in animals. Taking into account the aforementioned, this PhD thesis concentrates on the valorisation of histopathology as a complementary tool for TB diagnosis, the assessment of various markers of interest in lymph nodes (LNs), and the exploration of molecular histology to provide insights into the immunopathogenesis of TB in cattle and pigs naturally infected with MTC. The first study in this thesis assesses the utility of histopathology as a supplementary tool for diagnosing bovine tuberculosis (bTB). A total of 230 cattle enrolled in the bTB control and eradication programme in Spain contributed blood samples (212) and LNs (681) for serological, bacteriological, and histopathological analysis. Among these, 71 LNs and 59 cattle tested positive through bacteriological examination, while real-time PCR detected positivity in 59 lymph nodes and 48 cattle from fresh tissue. Approximately 19 % (40 out of 212) of the serum samples showed positivity in ELISA tests. Tuberculous-like lesions were identified in 11.9 % (81 out of 681) of the LNs and 30.9 % (71 out of 230) of the cattle. Notably, 18 out of 83 animals tested negative in SIT/PCR/culture, of which 11 out of 18 exhibited Ziehl-Neelsen positivity, with two of them testing positive for IS6110 digital PCR (dPCR). Six of these 11 ZN+ cases were associated with mesenteric lymph nodes and were confirmed to be positive for paratuberculosis. Histopathology demonstrated a sensitivity of 91.3 % (95 % CI: 83.2 - 99.4 %) and a specificity of 84.4 % (95 % CI: 78.6 - 89.3 %) with substantial concordance (k = 0.626) when compared to real-time PCR. Our findings underscore the significant role of histopathology in bTB diagnosis and monitoring, emphasizing the importance of incorporating this technique alongside other diagnostic tools to enhance disease control. The second study aims to analyse macrophage polarisation within granulomas in the LNs of cattle and pigs naturally infected with MTC. The tuberculous granulomas were microscopically categorized into four stages and examined through immunohistochemistry, utilizing a panel of myeloid cell markers (CD172a/MAC387), markers for M1 macrophage polarisation (iNOS/CD68/CD107a), and markers for M2 macrophage polarisation (Arg1/CD163). The results revealed that CD172a and MAC387 exhibited similar patterns, with the latter displaying higher expression in latephase granulomas in pigs. Within the M1 panel, iNOS and CD68 expression predominated in cattle compared to pigs, particularly showing higher expression in early-stage granulomas. CD107a labelling was observed exclusively in porcine granulomas, with greater expression in stage I granulomas. Concerning the M2 panel, the expression of Arg1+ cells was significantly higher in pigs than in cattle, particularly in late-stage granulomas. Quantitative analysis of CD163+ cells demonstrated consistent kinetics in both species, with a consistent frequency of immunolabelled cells across different granuloma stages. Our findings indicate that M1 macrophage polarisation prevails in cattle during the early stages of granulomas (I and II), while an M2 phenotype is also observed in later stages. In contrast, primarily due to Arg1 expression, M2 macrophage polarisation predominates in all granuloma stages in pigs. The third study focuses on comparing the protein signature of granulomas in NLs belonging to cattle and pigs naturally infected by MTC by MALDI-MSI, identifying the potential involvement of these proteins in biological and immunological pathways activated throughout the disease, as well as those differentially expressed between cattle and pigs. For this, samples from 4 NLs from cattle and pigs with presence of tuberculous granuloma and, positive for MTC by bacteriological culture and/or realtime PCR, were used. MALDI-MSI was performed using an AB-Sciex 5800 MALDI TOF/TOF mass spectrometer (AB Sciex, Germany). The results showed a clear separation between bovine and porcine masses, evidencing a different proteome in the granulomas of both species. Surprisingly, some Gene Ontology (GO) terms coincided in both species, presenting some proteins in common. Among the GO terms observed, "Complement activation" was found in both cattle and pigs, while "Natural killer cell degranulation" was evident in cattle and "Negative regulation of natural killer cellmediated immunity" in pigs. These findings offer fresh insights into the host immune response in bovine and porcine TB, underscoring the significance of the complement activation pathway and the regulation of NK cell-mediated immunity in combating tuberculosis infection.