Regulación y actividad de CaTrk1, CaAcu1 y CaHak1, los tres transportadores de potasio de la membrana plasmática de C.albicans

Abstract

C. albicans es una levadura diploide y patógeno oportunista que se encuentra presente como comensal en la mayoría de los individuos sanos de forma inofensiva. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, esta levadura se convierte en uno de los principales patógenos causantes de infecciones fúngicas en el ser humano, provocando desde enfermedades leves hasta enfermedades potencialmente letales. Al igual que en todos los seres vivos, el potasio es un catión esencial para este microorganismo, por lo que, para obtener la cantidad necesaria para su supervivencia, C. albicans compite con las células de su huésped por el potasio extracelular disponible en el organismo, que suele estar presente a baja concentración (nmol/L) extracelular. Para poder obtener este catión, C. albicans ha desarrollado tres sistemas de transporte de potasio diferentes en su membrana plasmática (Trk1, Acu1 y Hak1). Este hecho hace a este microorganismo particularmente interesante al ser de las pocas levaduras que contiene en su membrana plasmática un transportador de potasio de cada familia. Previamente a esta Tesis Doctoral, se tenía poca información respecto a la homeostasis de potasio en este microorganismo, ya que solo se conocía la existencia de estos transportadores en su membrana plasmática, y que el gen ACU1 había sido caracterizado como un pseudogen, no encontrándose presente de forma funcional en todas las cepas de C. albicans. Por estas razones y para ampliar el conocimiento que se tenía hasta la fecha, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar el proceso de la homeostasis en C. albicans. Para ello, se ha llevado a cabo un análisis de estos transportadores en dos cepas “silvestres” de C. albicans: la cepa 12C, que contiene los tres transportadores de K+ (Trk1, Acu1 y Hak1) y la cepa SC5314, que es ampliamente utilizada como cepa de referencia, pero contiene solo dos transportadores de K+ (Trk1 y Hak1). Para poder comprender mejor el papel de cada transportador de forma independiente, se intentó obtener mutantes mediante el sistema CRISPR/Cas9. Sin embargo, debido a los problemas encontrados para obtener estos mutantes, finalmente se decidió realizar dos aproximaciones: en primer lugar, mediante la expresión heteróloga de estos transportadores en una cepa mutante de S. cerevisiae carente de sus transportadores de potasio endógenos (trk1Δtrk2Δ) y, en segundo lugar, mediante la caracterización de una cepa mutante hak1- obtenida anteriormente para estudiar el papel del transportador Hak1 en la homeostasis de potasio de C. albicans. En esta Tesis Doctoral hemos logrado demostrar que C. albicans cuenta con unos sistemas de transporte de potasio altamente eficientes que, de forma independiente, son más que suficientes para que este microorganismo sea capaz de adquirir eficazmente el potasio necesario para su supervivencia. Asimismo, demostramos que el transportador Hak1 es especialmente importante en condiciones de pH ácido, donde todo indica que funciona como un simportador de K+:H+. Además, se han relacionado algunos de estos transportadores con la tolerancia a diversos iones como son el sodio o el litio. Los estudios del perfil transcriptómico han evidenciado que, como ocurre en otras levaduras, el gen TRK1 no se encuentra regulado transcripcionalmente de forma importante en ninguna de las condiciones de estrés estudiadas mientras que los genes ACU1 y HAK1 se encuentran fuertemente regulados por el ayuno de potasio.

C. albicans is a diploid yeast and opportunistic pathogen that is harmlessly present as a commensal in most healthy individuals. However, under certain conditions, this yeast becomes one of the main pathogens causing fungal infections in humans, causing mild to life-threatening illnesses. As in all living beings, potassium is an essential cation for this microorganism. Therefore, to obtain the potassium necessary for its survival, C. albicans competes with the cells of its host for the extracellular potassium available in the organism, which is usually present at a low concentration (nmol/L) extracellularly. In order to obtain this cation, C. albicans contains three different potassium transport systems in its plasma membrane (Trk1, Acu1 and Hak1). This fact makes this microorganism particularly interesting as it is one of the few yeasts that contains a potassium transporter from each family in its plasma membrane. Before this Thesis, little information was available regarding potassium homeostasis in this microorganism, since the existence of these transporters was only detected in its plasma membrane, and the ACU1 gene had been characterized as a pseudogene, not being functionally present in all strains of C. albicans. For these reasons and to broaden the knowledge available to date, the general objective of this Thesis has been to study the process of homeostasis in C. albicans. For this, an analysis of these transporters has been carried out in two "wild type" strains of C. albicans: strain 12C, which contains the three K+ transporters (Trk1, Acu1 and Hak1) and strain SC5314, which is widely used as a reference strain, but contains only two K+ transporters (Trk1 and Hak1). In order to better understand the role of each transporter independently, we tried to obtain mutants using the CRISPR/Cas9 system. However, due to the problems encountered in obtaining these mutants. We finally carried out two approaches: first, through the heterologous expression of these transporters in a mutant strain of S. cerevisiae lacking its endogenous potassium transporters (trk1 Δtrk2Δ) and secondly, by characterizing a mutant strain previously obtained to study the role of the Hak1 transporter in C. albicans potassium homeostasis. In this Thesis we have managed to demonstrate that C. albicans has highly efficient potassium transport systems that, independently, are more than sufficient for this microorganism to be able to efficiently acquire the potassium necessary for its survival. Likewise, we show that the Hak1 transporter is especially important in acidic pH conditions, where everything indicates that it functions as a K+::H+ symporter. In addition, some of these transporters have been related to tolerance to various toxic cations such as sodium or lithium. Studies of the transcriptomic profile have shown that, as in other yeasts, the TRK1 gene is not significantly transcriptionally regulated under any of the stress conditions studied, while the ACU1 and HAK1 genes are strongly regulated by potassium starvation.